長壽人群HBB基因多態(tài)性對HBB mRNA血清表達(dá)水平的影響及其與代謝指標(biāo)的關(guān)系*

宋重陽，崔晨曦，王癸丁，彭均華，潘尚領(lǐng)

（廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 長壽與老年相關(guān)疾病教育部重點實驗室，南寧 530021）

衰老是心血管疾病、糖尿病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病等慢性疾病的主要危險因素[1]。醫(yī)療保健的改善提高了全人類的預(yù)期壽命，但隨之而來的是人口老齡化引發(fā)的衰老相關(guān)性疾病的增加。長壽亦稱健康衰老或成功衰老，是人類最為復(fù)雜的表型之一。長壽個體規(guī)避了多數(shù)衰老相關(guān)性疾病，可能得益于其自律的生活習(xí)慣及獨特的遺傳學(xué)背景。對長壽群體遺傳學(xué)優(yōu)勢的探索有助于解析衰老之謎，進(jìn)一步提高人類健康壽限。

人類β-珠蛋白（β-globin，HBB）基因編碼血紅蛋白的β 亞基，主要表達(dá)于紅細(xì)胞。2 條β 肽鏈與2 條α-珠蛋白（α-globin，HBA）肽鏈共同組成血紅蛋白，用于攜帶氧氣。HBB的基因突變可以引起兩種非常常見的遺傳性疾病，即β-地中海貧血和鐮狀細(xì)胞病。近年研究發(fā)現(xiàn)，HBB 也可以表達(dá)于其他細(xì)胞，并在血清中維持一定的水平，影響人體鐵蛋白和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生[2-3]，與腎炎、自身免疫疾病、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病等老年性疾病有著密切的關(guān)系[4-6]。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HBB在年輕人和老年人血清中的mRNA 表達(dá)水平存在顯著差異，推測HBB可能與長壽存在一定的相關(guān)性[7]。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)長壽人群血清HBBmRNA 表達(dá)水平顯著低于對照組，但機制未明[8]。衰老是一個復(fù)雜的過程，涉及到諸多環(huán)境因素及遺傳學(xué)因素的相互作用。一些基因的多態(tài)性可通過影響機體的能量代謝等途徑對衰老過程產(chǎn)生影響[1,9]。廣西紅水河流域是著名的長壽地區(qū)，且人群遺傳背景相對單一，適合進(jìn)行長壽及衰老相關(guān)疾病的研究。本研究對廣西紅水河流域長壽群體的HBB基因全長進(jìn)行多態(tài)性檢測，并分析其對HBB血清表達(dá)水平的影響及其與多個代謝指標(biāo)的相關(guān)性，以初步了解HBB基因多態(tài)性在人類衰老中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究采用隨機抽樣的方法，選取2019 年10 月至2021 年4 月廣西紅水河流域長壽帶（巴馬縣、鳳山縣和東蘭縣）研究對象364例，其中長壽組168 例，男42 例，女126 例，年齡90～112 歲，平均（93.21±3.17）歲；對照組196 例，男104 例，女92例，年齡22～84 歲，平均（57.95±15.23）歲。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：20160304-25），所有受檢者均簽署知情同意書。所有對象均接受問診、體格檢查及化驗檢查，排除糖尿病、高血壓、中風(fēng)等常見老年病。

1.2 樣本采集 研究對象空腹12 h，清晨采集外周靜脈血7 mL，其中3 mL為抗凝處理，用于提取DNA及基因分型，4 mL 為非抗凝處理，采取血液后常溫靜置30 min，3 000 r/min 離心5 min，取上層血清分離后置于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 血液生化指標(biāo)檢測 空腹血糖（fasting bloodglucose，F(xiàn)BG）為采血現(xiàn)場使用微量血糖儀（羅氏ACCU-CHEL Active）檢測。總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、載脂蛋白A（apolipoprotein A1，ApoA1）、載脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）、肌酐（creatinine，Cr）及尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）均由廣西江濱醫(yī)院檢驗科檢測。

1.4HBB全長區(qū)域基因多態(tài)性分析 上游引物序列：5’-TGTTTTAAATGCACTGACCTCCCA-3’，下游：5’-TACTGATGGTATGGGGCCAAGA-3’，產(chǎn)物大小為1 900 bp。PCR反應(yīng)體系：2×Taq master mix（Cwbio,no.30303）10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板50 ng，加Nuclease-Free Water 至20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃3 min 預(yù)變性，94 ℃30 s，61 ℃30 s，72 ℃1 min，反應(yīng)35 個循環(huán)。產(chǎn)物鑒定后送上海生工生物工程有限公司完成測序。

1.5 血清HBBmRNA 表達(dá)水平檢測 取各組血清樣本，使用HipureLiquied RNA Kit（Magen，R4163）試劑盒提取血清總RNA，并將其逆轉(zhuǎn)錄（vazyme，R323-01）為cDNA，使用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測血清HBBmRNA 相對表達(dá)量。HBB上游引物序列為：5’-GCACGTGGATCCTGAGAACT-3’，下游：5’-ATTGGACAGCAAGAAAGCGA-3’，產(chǎn)物長度為176 bp。以RNA5S9為內(nèi)參校正加樣量差異，RNA5S9上游引物序列為：5’-GTCTACAGCCATACCACCC-3’，下游：5’-CTCCCATCCAAGTACTAACC-3’，產(chǎn)物長度為89 bp；HBBmRNA相對表達(dá)量用2-△△CT法計算。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗，服從正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較用t檢驗，多組間比較用方差分析進(jìn)行，兩兩比較采用LSD-t檢驗，不服從正態(tài)分布的計量資料采用非參數(shù)檢驗，使用中位數(shù)四分位間距[M（QR）]表示。采用卡方檢驗分析位點基因型和等位基因在不同組內(nèi)的分布差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本臨床資料比較

長壽組血清TC、TG、HDL、ApoA1 與ApoB 水平低于對照組（P＜0.05）；而長壽組血清的BUN 則高于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 各組基本臨床資料比較

表1 各組基本臨床資料比較

2.2 各組血清HBBmRNA表達(dá)水平

長壽組的血清HBBmRNA 表達(dá)水平低于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 各組人群血清HBB mRNA表達(dá)水平比較M（QR）

2.3HBB基因多態(tài)性在各組人群中的分布

本研究利用PCR-Sanger 測序法檢測了紅水河流域人群的HBB全長序列多態(tài)性，共檢出6個SNP位點，分別是rs1609812、rs7946748、rs7480526、rs10768683、rs33986703 和rs713040，所有位點均遵循Hardy-Weinberg定律。通過卡方檢驗對這6個位點的基因型和等位基因頻率分布分析，發(fā)現(xiàn)rs7480526 位點和rs33986703 位點基因型及等位基因頻率在長壽組與對照組之間存在差異，而其余4 個位點的結(jié)果差異不明顯。因此，本文只展示rs7480526 及rs33986703 位點（表3、表4）。結(jié)果顯示，在總體人群中，rs7480526 以A 等位基因為主，rs33986703 以T 等位基因為主。長壽組rs7480526 A/A基因型的頻率高于對照組（P＜0.05），其他基因型及等位基因頻率在各組間的分布無明顯差異（P＞0.05）。長壽組rs33986703 基因型T/T 及等位基因T 的頻率低于對照組（P＜0.05）。但是由于檢出的rs33986703位點的最小等位基因頻率小于5%，可能需要進(jìn)一步擴大樣本量來驗證和完善結(jié)果。

表3 各組人群rs7480526的基因型與等位基因頻率分布n（%）

表4 各組人群rs33986703的基因型與等位基因頻率分布n（%）

2.4 HBB rs7480526、rs33986703基因型對血清HBB mRNA相對表達(dá)量的影響

因HBBrs7480526 突變的A/C 及C/C 基因型較少，故把A/C 和C/C 合并后（即非A/A 攜帶者）與野生純合A/A 比較，發(fā)現(xiàn)長壽組A/A 基因型的mRNA表達(dá)水平低于對照組（P＜0.05）；各組A/A基因型攜帶者的HBBmRNA 表達(dá)水平與非A/A 攜帶者無顯著差異（P＞0.05）（圖1 a）。長壽組rs33986703 T/T基因型攜帶者HBBmRNA 的血清表達(dá)水平亦顯著低于對照組（P＜0.01），各組T/T 攜帶者的HBBmRNA 表達(dá)水平與T/A 攜帶者比較無差異（P＞0.05）（圖1 b）。

課程的校內(nèi)實訓(xùn)基地建筑面積2355平方米，設(shè)有護(hù)理示教室、仿真護(hù)理病區(qū)、重癥監(jiān)護(hù)室等22個仿真實訓(xùn)室；教學(xué)儀器設(shè)施600多臺，價值人民幣800余萬元，并在此多次舉行各種類型市級以上衛(wèi)生行業(yè)比賽和培訓(xùn)，融教學(xué)和多種社會功能于一體。校外實訓(xùn)基地分布在北京、浙江、江西、湖北等省市的30多所綜合性醫(yī)院，校外實訓(xùn)基地采取學(xué)校與醫(yī)院共同建設(shè)、共同管理的形式。

圖1 rs7480526和rs33986703基因型對HBB mRNA血清相對表達(dá)量的影響

2.5 各組人群rs7480526、rs33986703基因多態(tài)性與血脂等臨床指標(biāo)的關(guān)系

在總體人群中，rs7480526 A/A基因型攜帶者的TG水平低于A/C攜帶者（P＜0.05），在對照組中，該基因型攜帶者的HDL 水平低于A/C 攜帶者（P＜0.05），其他基因型對其他代謝指標(biāo)的影響在長壽組之間無顯著差異（P＞0.05）（表5）。在總體人群中rs33986703 T/T攜帶者的ApoA1 水平高于T/A 攜帶者，這兩個基因型攜帶者的其他代謝指標(biāo)在長壽組及對照組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表6）。

表5 各組人群rs7480526的基因型與代謝相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系

表5 各組人群rs7480526的基因型與代謝相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系

與同組A/C基因型比較，*P＜0.05。

表6 各組人群rs33986703的基因型與代謝指標(biāo)的關(guān)系

表6 各組人群rs33986703的基因型與代謝指標(biāo)的關(guān)系

與同組T/A基因型比較，*P＜0.05。

3 討論

HBB 是珠蛋白家族成員，含血紅素基團，具有可逆性結(jié)合紅細(xì)胞中氧氣的能力，通常認(rèn)為HBB功能障礙與多種遺傳學(xué)血液疾病相關(guān)[10]。血紅蛋白與鐵蛋白的代謝高度相關(guān)，HBB功能障礙會造成鐵超載，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞器損傷，引發(fā)炎癥及心肌病變等[11-13]。近年來，Vanni 等[14]研究發(fā)現(xiàn)HBBmRNA 水平可能對衰老相關(guān)疾病有一定影響。本課題組的前期工作[8]及本次研究均發(fā)現(xiàn)，長壽組HBBmRNA 表達(dá)水平均低于對照組，與Vanni 的結(jié)果類似，提示HBB基因可能通過某種機制影響衰老相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展及個體壽限。鑒此，本研究探討HBBmRNA 表達(dá)是否受其基因多態(tài)的影響并進(jìn)一步作用于代謝指標(biāo)。

通過比較HBB基因多態(tài)性在不同年齡組的分布，本研究發(fā)現(xiàn)長壽組rs7480526 A/A基因型的頻率顯著高于對照組，而長壽組rs33986703 基因型T/T及等位基因T 的頻率低于對照組?；蛐团cHBBmRNA的相關(guān)分析顯示，長壽組rs7480526 A/A基因型的mRNA表達(dá)水平低于對照組；長壽組rs33986703 T/T 基因型攜帶者HBBmRNA 的血清表達(dá)水平亦低于對照組。根據(jù)這些結(jié)果，我們推測，rs7480526 A/A 基因型是長壽的有利因素，可能通過表觀遺傳途徑降低HBBmRNA的表達(dá)水平，減緩衰老進(jìn)程而有利于健康長壽，而rs33986703 基因型T/T 在長壽組中頻率較低，亦即在普通人群中頻率較高，為長壽的不利因素，可能通過調(diào)高HBBmRNA影響普通人群的衰老進(jìn)程。

多個研究已表明TG等心血管疾病危險因素會激活炎癥和氧化應(yīng)激，或促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生導(dǎo)致動脈粥樣硬化性心臟病[15-16]。為進(jìn)一步探究HBB基因多態(tài)性對長壽的影響，本研究分析了不同基因型與TC、TG、ApoA1等多個影響心血管功能的代謝相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)rs7480526 位點不同基因型個體間的TG 水平存在差異。A/A 基因型個體的TG水平低于A/C基因型，由于A/C基因型在對照組中富集，提示了A/C 基因型的高TG 水平可能加重血脂代償，增加機體罹患心血管相關(guān)性疾病的風(fēng)險而影響壽限。而長壽人群存在更多的A/A基因型，可能通過降低血清HBBmRNA表達(dá)水平來規(guī)避這一風(fēng)險。rs33986703 位點中T/A 基因型的ApoA1水平低于T/T基因型（P＜0.05），本研究中長壽組的樣本具有較高水平的腎代謝功能相關(guān)指標(biāo)和較低水平的HDL 和ApoA1 等，這可能是由于隨著年齡增長，長壽人群腎代謝功能相對降低、炎性因子代償性增高或HDL 結(jié)構(gòu)改變。而過高或過低的HDL 和ApoA1 水平都會增加患心血管疾病的風(fēng)險[17-19]。因此，長壽組較少的T/T基因型可能是通過影響血清的HBBmRNA 與ApoA1 水平，規(guī)避心血管相關(guān)性疾病，延長機體壽限。

衰老是機體生理完整性的逐步喪失以及生理功能性的損傷過程。衰老受生活環(huán)境、生活方式以及遺傳因素等一系列復(fù)雜因素的影響，并與心腦血管疾病和糖尿病等疾病高度相關(guān)。目前HBB 對衰老的影響機制尚未闡明，HBBrs7480526、rs33986703位點的基因多態(tài)性尚未見到其他研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)，HBB基因多態(tài)性與血脂等代謝指標(biāo)有密切的關(guān)系，并且可能通過影響血清HBBmRNA表達(dá)水平影響機體衰老的相關(guān)進(jìn)程，但在不同年齡層次中發(fā)揮調(diào)控作用的基因型可能有所不同。由于衰老是極其復(fù)雜的生理過程，所以本研究的結(jié)果仍需結(jié)合飲食習(xí)慣、生存環(huán)境等多種因素進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。