金雀異黃酮對脂多糖誘導的軟骨細胞氧化應激和炎癥因子的影響*

王勇麟，王哲緯,2，楊 淵,2△

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院骨關節外科，南寧 530021；2.廣西醫科大學再生醫學與醫用生物資源開發應用省部共建協同創新中心，南寧 530021）

骨關節炎（OA）是關節最常見的退行性疾病，致殘率較高，其特征為進行性軟骨破壞，軟骨下骨板增厚，滑膜內不同程度的炎癥導致關節僵硬、慢性疼痛和功能障礙[1-3]。活性氧（ROS）在OA的發病中起到關鍵作用。ROS含量過高時引起氧化應激，激活炎癥通路，導致細胞外基質（ECM）降解和炎癥發生[4-5]。雖然非甾體抗炎藥、阿片類藥物等能減輕OA 疼痛，但不能有效治療OA，并且長期使用有較多副作用[6]。因此，尋找一種可以抑制氧化應激和炎癥的OA治療方法。

金雀異黃酮（化學名稱為4',5,7-三羥基異黃酮）廣泛存在于大豆、三葉草根及各種水果、蔬菜等天然植物中。豆科植物中金雀異黃酮含量較高，占人類膳食來源異黃酮的60%[7]。天然植物中異黃酮是多酚類混合物，主要包括金雀異黃酮和大豆黃素等。金雀異黃酮的結構與雌激素相似，并具有弱雌激素效應，故又稱之為植物雌激素[8]。研究表明，金雀異黃酮具有預防骨質疏松癥、降低心血管疾病風險、緩解絕經后癥狀和抗癌特性[9]。大量研究表明，金雀異黃酮具有抑制細胞凋亡、抑制神經炎癥、誘導自噬等作用。但金雀異黃酮在OA中的作用鮮少報道。本研究旨在探討金雀異黃酮對脂多糖（LPS）誘導的軟骨細胞炎癥及氧化應激的影響，為金雀異黃酮治療OA提供實驗和理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑 金雀異黃酮（純度≥97%，麥克林，中國）；逆轉錄試劑盒（Fermentas Company，美國）；LPS、青—鏈霉素、細胞計數試劑盒（CCK-8）檢測、總RNA 提取試劑盒、番紅O 染色試劑盒（Solarbio，中國）；Calcein-AM/EthD-I染色試劑（百奧萊博，中國）；基質金屬蛋白酶（MMP）-13抗體、FITC免疫熒光抗體（博士德，美國）；二型膠原酶（Sigma，美國）；胎牛血清、DMEM 培養基（Gibco，美國）；引物（金開瑞，中國）。

1.2 軟骨細胞的提取、培養及鑒定 取3～5 日齡SD大鼠乳鼠（購自廣西醫科大學實驗動物中心），過量麻醉處死，備皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮膚，在無菌操作臺上剪取雙側股骨頭及膝關節（保留周圍肌肉，軟骨不能暴露），置于含1%青—鏈霉素的PBS 中，去除軟骨周圍組織，將軟骨剪為1 mm×1 mm×1 mm的小塊，胰蛋白酶消化30 min，含2 mg/mL的Ⅱ型膠原酶37 ℃下消化4 h，1 000 r/min離心5 min，收集并重懸細胞于DMEM 培養基，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。每兩天換1 次液，細胞生長密度達到90%匯合度時進行傳代，用第3 代細胞進行后續實驗[10]。通過番紅O 染色法進行軟骨細胞鑒定。

1.3 CCK-8 法檢測金雀異黃酮的細胞毒性 將軟骨細胞按5 000 個/孔的密度接種于96 孔板，培養24 h 后，分別加入含0 μg/mL（對照）、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50μg/mL、60μg/mL 金雀異黃酮的無血清培養基；繼續培養24 h 后棄去原培養基，加入含10%CCK-8的DMEM培養基100 μL，繼續避光孵育2 h；用酶標儀檢測450 nm 波長處各孔的吸光度（OD）值。計算細胞存活率，細胞存活率=[（實驗孔OD值－空白孔OD 值）/（對照孔OD 值－空白孔OD值）]×100%。

1.4 實驗分組與處理 將軟骨細胞分為空白對照組、模型組和實驗組。空白對照組不作處理，模型組用含1μg/mL LPS 的完全培養基進行炎癥誘導，實驗組用1μg/mL LPS誘導建立軟骨細胞炎癥模型1 h后，加入20μg/mL的金雀異黃酮干預24 h。

1.5 Calcein-AM/EthD-I 染色檢測細胞活性 將細胞接種于放置細胞爬片的6 孔板中，細胞密度約為2×105個/孔。分組處理后在暗室中加入0.05%Calcein-AM 和0.2%EthD-I 染色試劑37 ℃孵育5 min，PBS 清洗3 次，在熒光顯微鏡下觀察細胞的生存情況并拍照，用Image J 軟件統計活細胞和死細胞數目，計算細胞增殖率。

1.6 DCFH-DA 熒光探針檢測軟骨細胞內ROS 水平 避光條件下按1∶1 000的比例用無血清培養基稀釋DCFH-DA。收集細胞，懸浮于1 mL 稀釋好的DCFH-DA 中，避光處理后放入37 ℃細胞培養箱中孵育20 min。用無血清細胞培養液洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。熒光顯微鏡下觀察熒光強度，用Image J軟件分析熒光強度的平均值，熒光強度越強，細胞內的ROS水平越高[11]。

1.7 免疫熒光染色檢測軟骨細胞內MMP-13 的分泌情況 細胞接種于6 孔板中，細胞貼壁80%時用含1 μg/mL LPS 的培養基誘導24 h，棄去孔板中培養基；用PBS 沖洗3 次，4%多聚甲醛固定15 min；PBS沖洗3次，滴加3%過氧化氫孵育20 min；PBS沖洗3 次，滴加適量山羊血清孵育15 min，棄去血清；滴加MMP-13一抗（1∶200）4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3 次，加入熒光二抗避光孵育1 h；PBS 沖洗3 次，洗去多余熒光二抗，DAPI染核。熒光顯微鏡下觀察，Image J 軟件分析熒光強度。綠色熒光強度越強，MMP-13表達水平越高。

1.8 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）法檢測炎癥基因和軟骨特異性基因表達 提取各組軟骨細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，進行PCR 擴增。以GAPDH作為內參，檢測炎癥基因白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、MMP-13以及軟骨特異性基因Col2al的表達。引物序列見表1。采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

表1 PCR引物序列

1.9 統計學方法 使用GraphPad Prism 8.0軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 金雀異黃酮的細胞毒性 當金雀異黃酮濃度大于40μg/mL 時細胞存活率降至80%以下，金雀異黃酮濃度≤10 μg/mL 時無明顯細胞毒性，見圖1。因此，選擇10 μg/mL 金雀異黃酮濃度進行后續實驗。

圖1 CCK-8檢測金雀異黃酮對軟骨細胞的毒性作用

2.2 軟骨細胞的鑒定結果及金雀異黃酮對LPS 誘導的軟骨細胞蛋白多糖的影響 番紅O染色中，堿性染料與細胞蛋白多糖結合，使細胞變為紅色，細胞具有分泌蛋白多糖的功能，表明提取的細胞為軟骨細胞。模型組紅色細胞數量較空白對照組減少，實驗組紅色細胞數量較模型組增多，即蛋白多糖較模型組增多，提示金雀異黃酮能促進蛋白多糖的分泌，見圖2。

圖2 軟骨細胞番紅O染色圖（×100，標尺=400 μm）

2.3 金雀異黃酮對軟骨細胞活力的影響 與空白對照組比較，模型組活細胞數量明顯減少，死細胞數量增多，細胞增殖率下降（P＜0.05）；經金雀異黃酮處理后，細胞增殖率升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 Calcein-AM/EthD-I染色檢測軟骨細胞活性（×100，標尺=400 μm）

2.4 金雀異黃酮對軟骨細胞內ROS 的影響 與空白對照組比較，模型組細胞內熒光強度提高（P＜0.05），即軟骨細胞內ROS 含量增高；與模型組比較，實驗組熒光強度下降（P＜0.05），即細胞內ROS含量降低，見圖4。

圖4 熒光探針檢測軟骨細胞內ROS水平（×100，標尺=400 μm）

2.5 軟骨細胞內MMP-13 表達情況 與空白對照組比較，模型組綠色熒光強度升高，細胞內MMP-13表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，實驗組綠色熒光強度降低，細胞內MMP-13 表達降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 免疫熒光檢測軟骨細胞內MMP-13的表達（×100，標尺=400 μm）

2.6 各組軟骨細胞IL-6、MMP-13、TNF-α、Col2al基因表達比較 與空白對照組比較，模型組IL-6、MMP-13、TNF-α基因表達上調，Col2al表達下調（均P＜0.05）；與模型組比較，實驗組Col2al表達上調，IL-6、MMP-13、TNF-α基因表達下調（均P＜0.05），見表2。

表2 各組軟骨細胞IL-6、MMP-13、TNF-α、Col2a1基因表達比較-x±s，n=3

3 討論

正常情況下，軟骨細胞可以分泌大量的蛋白多糖，這些蛋白多糖能夠被MMP降解，從而維持細胞支撐力量的循環和平衡；受損的軟骨細胞可以分泌過量的MMP，導致上述平衡受到破壞，引起軟骨細胞支撐力量缺失，誘導OA的發生[12]。MMP是ECM降解的重要源頭，MMP-13能夠將Ⅱ型膠原、Ⅰ型膠原和蛋白聚糖等降解，其中Ⅱ型膠原是軟骨膠原的主要組成部分，其與蛋白聚糖共同維持軟骨的彈性[13]。本研究結果顯示，金雀異黃酮能夠促進蛋白多糖的分泌，上調軟骨細胞中Col2al的表達，抑制OA 軟骨細胞中MMP-13 的表達。提示金雀異黃酮可通過抑制ECM降解發揮抗OA的作用。

TNF-α和IL-6等促炎細胞因子在OA中起著重要作用[14]。氧化應激是指機體受到炎癥因子等有害刺激后導致機體內抗氧化能力降低，引起ROS的產生增多，從而導致氧化損傷。本研究發現，金雀異黃酮能下調LPS 誘導的軟骨細胞IL-6、TNF-α基因表達，同時降低細胞內ROS 水平，提示金雀異黃酮可以發揮抗炎、抗氧化的作用。

綜上所述，金雀異黃酮能夠抑制炎性軟骨細胞的炎癥反應和氧化應激，上調軟骨特異性基因的表達。這為今后研究金雀異黃酮抗OA的作用機制提供了依據，為OA的治療提供了參考。