診斷超聲與超聲治療儀聯合載阿霉素超聲納米泡作用于鼻咽癌細胞的體外實驗研究*

陸柳桂，黃釗希，韋麗艷，高 泳

(廣西醫科大學第一附屬醫院超聲科，南寧 530021)

鼻咽癌為中國南部和東南亞地區好發的惡性腫瘤，中、晚期鼻咽癌的治療以放療或同步放化療為主[1]。阿霉素（doxorubicin，Dox）是一種廣譜周期非特異性抗腫瘤藥物，但其嚴重的心腎毒副作用，大大限制其在臨床上的應用[2]。國內外較多研究表明，載阿霉素超聲納米微泡（Dox-NBs）聯合超聲輻照目標組織可有效促進Dox-NBs 向血管外腫瘤組織滲透，并釋放納米微泡所包封的藥物，增加藥物靶向利用率和細胞毒性，提高腫瘤化療療效[3-5]。近年來，利用超聲治療儀（therapeutic ultrasound，TUS）或診斷超聲（diagnostic ultrasound，DUS）聯合載藥或基因納米微泡在輻照部位產生空化效應，使腫瘤血管內皮細胞間隙增大，提高藥物或基因從血管滲入腫瘤組織的治療方法已有較多的研究[6-10]，但對比DUS 與TUS 分別聯合載藥超聲納米泡對腫瘤化療效果的評價，目前國內、外鮮見報道。因此，本研究通過制備Dox-NBs并檢測其基本物理特性，研究其分別聯合DUS 與TUS 體外藥物釋放情況及對鼻咽癌腫瘤細胞活性的影響，旨在為后續體內選擇DUS或TUS輻照輔助腫瘤化療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 1，2-二棕櫚酰-錫-甘油基-3-磷酸膽堿（DPPC）、MPEG-2000-DSPE（北京謹明生物科技有限公司）；1，2-二棕櫚酰基-sn-丙三基-3-和磷酸乙氨醇（DPPE）、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸（DPPA）、甘油、鹽酸Dox、N，N'-雙（丙稀酰）胱胺（BAC）、Irgacure2959（上海麥克林生化科技有限公司）；氯仿（成都科隆化學品有限公司）；全氟丙烷氣體（C3F8,深圳金谷氣體有限公司）；Pluronic124（美國Sigma-Aldrich）；N，N′-二乙基丙酰胺（NNDEA，上海賢鼎生物科技有限公司）；甲醇（四川西隴科學有限公司）；1×PBS緩沖液 無菌（pH=7.0～7.2，Biosharp）；細胞計數試劑盒（CCK-8）（批號：21340324，Biosharp）。

1.1.2 主要儀器 XS205DU十萬分之一天平（梅特勒-托利多）；KQ-501DB超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；XD-W2308 加熱板（深圳市興達恒業科技有限公司）；HH-420恒溫水浴鍋（金壇市易晨儀器有限公司）；HL-AH（G8）銀汞調和器（杭州中潤醫療器械有限公司）；Zetasizer NanoZS 納米粒度電位儀（英國馬爾文儀器有限公司）；EVOS FL Auto顯微鏡（美國Life Technologies公司）；血球計數板（上海市求精生化試劑儀器有限公司）；UT1021 超聲治療儀（深圳東迪欣科技有限公司）；診斷超聲（美國GE LOGIQ E9）；冷凍干燥機（德國ALPHA 1-2 LD plus）；Synergy H1 多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；85-2恒溫磁力加熱攪拌器（常州翔天實驗儀器廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 Dox-NBs 的制備（1）稱取一定比例的DPPC、DPPA、DPPE和MPEG-2000-DSPE，與氯仿形成混合液，在37 ℃超聲波清洗儀振蕩充分溶解；（2）將溶液分裝至西林瓶，放置在加熱板揮發呈薄膜狀；（3）加入一定比例的Pluronic 124、Dox、Irgacure 2959 溶液及甘油，65 ℃水浴鍋中30 min 混合均勻；（4）注入C3F8 氣體；（5）銀汞調和器高速振蕩60 s，254 nm 紫外燈下照射30 min，4 ℃倒置分層1 h，取下清液即為Dox-NBs。

1.2.2 Dox-NBs 表征檢測 熒光顯微鏡觀察納米泡載阿霉素情況。用PBS 緩沖液稀釋Dox-NBs 1 000 倍后放入粒徑、電位樣品池中，利用納米粒度電位儀檢測儀測定樣本的粒徑、電位及分散度，儀器設置條件如下：T=25°C，激光波長=660 nm，角度=90°。普通光學顯微鏡觀察Dox-NBs 形態分布情況，用PBS 緩沖液將Dox-NBs 稀釋5 倍后，利用血球計數板計數Dox-NBs濃度。

1.2.3 Dox-NBs 中Dox 平均載藥量及包封率的測定（1）使用分子截留量為12 000～14 000 u 透析袋將Dox-NBs 中游離的Dox 去除；（2）將透析好的樣品在冷凍干燥機凍干；（3）稱重凍干的載Dox 納米顆粒，并將其以體積1∶1 的比例溶解在甲醇和PBS的混合溶液中；（4）在酶標儀波長λ=483 nm 條件下繪制Dox 濃度—吸光度標準曲線方程，檢測計算Dox-NBs 包封Dox 的量。平均載藥量=包封Dox 的量（μg）/凍干的載Dox 納米顆粒的重量（mg），包封率%=包封Dox 的量（μg）/初始投入的量（μg）×100%。

1.2.4 體外Dox-NBs聯合超聲輻照Dox的釋放

（1）按照實驗方法分為3 組：Dox-NBs 組、Dox-NBs+DUS 組、Dox-NBs+TUS 組；（2）分別取樣品稀釋至5 mL 置于透析袋中，封口；（3）其中Dox-NBs+DUS 組輻照時間為3 min，頻率為5.5 MHz，機械指數1.2，TIS 0.3，Dox-NBs+TUS組輻照時間為3 min，頻率為3 MHz，占空比20 %，聲強1 W/cm2，放入200 mL PBS容器中；（4）容器置于37 ℃磁力攪拌器上以100 r/min的速度旋轉；（5）分別于1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、8 h、11 h、24 h 取容器中透析出的Dox 溶液1 mL 并用1 mL PBS 置換，利用酶標儀檢測計算不同時間點所取樣品中Dox 含量，計算不同時間點Dox-NBs 的累計釋放Dox 百分比，繪制累積釋放率-時間曲線。

1.2.5 鼻咽癌細胞活性檢測（1）鼻咽癌5-8F細胞用含10 % 胎牛血清的1640 培養基培養，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養，取對數生長期細胞，以2.5×104/孔種植于96 孔板中，每孔100 μL,過夜培養使其貼壁；（2）按照不同的處理方法分為4 組：對照組、Dox-NBs 組、Dox-NBs+DUS 組、Dox-NBs+TUS 組，其中對照組用無菌PBS 緩沖液處理，Dox-NBs+DUS 組輻照時間為3 min，頻率為5.5 MHz，機械指數1.2，TIS 0.3，Dox-NBs+TUS組輻照時間為3 min，頻率為3 MHz，占空比20%，聲強1 W/cm2；（3）室溫環境孵育3 h 后，取出處理液，用PBS 清洗細胞2 次，完全培養基培養3 d；（4）按CCK-8的說明，換用添加了10%體積的CCK-8溶液的新鮮培養基100 μL進行孵育1.5 h，在多功能酶標儀上測定波長在450 nm時的吸光度值，利用公式計算細胞存活率（%）=（OD處理-OD空白）/（OD對照-OD空白）×100%。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（）表示，多組均數間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD-t檢驗，方差不齊者用Dunnett’s T3 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Dox-NBs的表征檢測

自制的Dox-NBs 外觀呈紅色懸濁液。熒光顯微鏡下顯示納米泡的脂質外殼載自帶熒光的Dox發出紅色熒光信號，呈圓形狀，見圖1。納米粒度電位儀檢測得Dox-NBs 的平均粒徑為（286.93±14.45）nm，多分散指數為（0.270±0.016），粒徑大小分布較集中且在較理想范圍，見圖2。Zeta 電位為（-13.3±2.17）mV，具有良好穩定性。光學顯微鏡下Dox-NBs呈空心圓形，分布均勻，未見大量聚集，見圖3，血球計數板計數Dox-NBs濃度為（5.63×108）個/mL。

圖1 熒光鏡觀察Dox-NBs載Dox情況（×400）

圖2 Dox-NBs粒徑檢測結果

圖3 光鏡觀察Dox-NBs形態分布（×400）

2.2 Dox-NBs中Dox平均載藥量及包封率的測定

酶標儀在波長λ=483 nm 條件下，繪制Dox 濃度-吸光度標準曲線方程為y=0.003 2x+0.036 9，R2=0.999 7，Dox-NBs 平均載藥量為（37.00±3.34）μg/mg，包封率為（36.30±1.92）%。

2.3 體外超聲輻照聯合Dox-NBs藥物釋放的比較

Dox-NBs組各個時間點累積釋放的Dox量均低于Dox-NBs+DUS組及Dox-NBs+TUS組（P＜0.05），其中Dox-NBs+DUS 組與Dox-NBs+TUS 組在2 h Dox 的累積釋放量分別為（38.50±0.71）%、（34.90±1.27）%，差異有統計學意義（P＜0.05）；在24 h Dox的累積釋放量分別為（81.80±0.56）%、（72.20±0.85）%，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖4 Dox-NBs與Dox-NBs聯合超聲輻照Dox釋放情況

2.4 鼻咽癌細胞的存活率的比較

Dox-NBs 組的細胞存活率高于Dox-NBs+DUS組與Dox-NBs+TUS 組（P＜0.01），提示Dox-NBs 聯合超聲輻對鼻咽癌細胞活性抑制作用更好，將Dox-NBs+DUS 組與Dox-NBs+TUS 組之間的細胞存活率比較，差異有統計學意義（P=0.01），而Dox-NBs+DUS 組的細胞存活率最低（表1），提示Dox-NBs+DUS組對鼻咽癌細胞活性抑制作用最大。

表1 各處理組細胞存活率比較%，

表1 各處理組細胞存活率比較%，

與對照組比較，#P＜0.001；與Dox-NBs 組比較，△P＜0.01；與Dox-NBs+DUS組比較，*P=0.01。

3 討論

已有研究證實，腫瘤血管內皮間隙的最大孔徑為380～780 nm，超聲納米泡可以通過腫瘤的高滲透長滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應滲透到腫瘤血管外的區域聚集[11]，如果輔以一定功率超聲輻照，便能將攜載的藥物釋放到腫瘤組織中[12-13]。這與超聲靶向微泡破壞（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）介導的聲孔效應有關[14]，一方面使腫瘤細胞膜通透性增高，有利于藥物進入腫瘤細胞，增加腫瘤細胞對化療藥物的攝取[15-16]。另一方面，UTMD 所誘導的空化效應促進載藥納米泡釋放所包封的藥物釋放,提高腫瘤局部藥物濃度[17]。因此，利用超聲靶向微泡破壞技術可以減少化療藥物的全身毒副作用并增加腫瘤組織有效化療藥物濃度。

近年多項研究發現，利用DUS聯合微泡能夠提高腫瘤化療的療效，楊希等[18]研究證明，DUS 聯合微泡輻照卡鉑緩釋微球能夠增加腫瘤血管及組織細胞膜通透性，提高VX2 皮下移植瘤局部化療療效。付赤學等[19]使用DUS頻率1.75 MHz，輸出強度MI 1.9,以間斷觸發方式輻照兔VX2腦腫瘤，間隔時間400 ms，結果顯示，DUS 聯合微泡能夠顯著提高紫杉醇對兔腦腫瘤的化療效果。Chen 等[20]通過載Dox 的PLGA 納米粒子微泡聯合DUS 通過調節兔肝腫瘤細胞Bax 和Blc-2 表達，促進腫瘤細胞調亡，提高抗腫瘤化療藥物的效率。目前對于DUS 聯合Dox-NBs 能否達到TUS 聯合Dox-NBs 輔助治療腫瘤的效果，尚未見報道。本研究的體外藥物釋放結果顯示，單純Dox-NBs累積釋放Dox的量低于Dox-NBs 聯合超聲輻照，表明Dox-NBs 在沒有超聲輻照時可保持相對穩定，從而減少全身的毒副作用。本研究結果還發現，DUS聯合Dox-NBs在體外Dox釋放量優于TUS 聯合Dox-NBs。本研究在檢測鼻咽癌細胞活性實驗結果進一步顯示，超聲輻照聯合Dox-NBs 對鼻咽癌細胞活性的抑制作用優于單純Dox-NBs，表明當Dox-NBs 超聲輻照聯合作用于腫瘤細胞時，通過產生的空化效應及聲孔效應能夠有效提高腫瘤細胞對化療藥物的攝取量，提高腫瘤組織化療藥物濃度，可實現化療藥物在腫瘤組織可控釋放，促進化療藥物對腫瘤細胞毒性作用，抑制腫瘤細胞活性，DUS聯合Dox-NBs對鼻咽癌細胞存活率的抑制作用優于TUS聯合Dox-NBs，這提示DUS聯合Dox-NBs可能具有輔助治療鼻咽癌的潛力。

在各處理組Dox-NBs濃度給定的情況下，不同超聲儀器輻照參數的差異是的主要因素[21-22]。本研究結果顯示，DUS聯合Dox-NBs在體外Dox釋放量以及體外對鼻咽癌細胞活性抑制作用比超聲治療儀聯合Dox-NBs 好，分析產生差異的原因可能為：（1）超聲儀器的輸出功率不同。低頻率TUS輸出功率單位為瓦，而DUS 輸出功率單位為毫瓦，因此兩者產生的生物學效應可能不同[23]；（2）低頻率TUS與臨床常用的DUS儀可調節的頻率不同，因此兩者產生的生物學效應可能不同；（3）除了輸出功率、頻率以外，低頻率TUS與DUS儀還有各自的一些作用參數存在不同，如低頻率TUS 的占空比、DUS 的機械指數等，這些差異使不同超聲儀器輻照聯合載藥超聲納米泡產生的空化效應不同，導致產生不同的作用效果。

本研究也存在一些不足之處：因超聲探頭輻照是通過96孔板對腫瘤細胞進行治療的，有可能影響超聲輻照對腫瘤細胞活性的抑制作用；本研究僅從DUS與TUS可設置的參數方面進行比較，存在一定的局限性。

綜上所述，本研究制備的Dox-NBs聯合超聲輻照可有效提高納米泡包封藥物的釋放量，DUS聯合Dox-NBs 輻照對體外藥物累積釋放量及細胞活性抑制效果略優于TUS聯合Dox-NBs，DUS能夠對病灶組織進行靶向定位成像，對深部腫瘤組織有足夠的穿透力，值得推廣應用。