HKαα及其復合-α4.2缺失型α地中海貧血的臨床分析*

馬晨驍，肖 璇，李樹全，陳 萍，張 學△

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院兒科，南寧 530021；2.國家衛生健康委地中海貧血防治重點實驗室，南寧 530021；3.中國醫學科學院地中海貧血防治研究重點實驗室，南寧 530021；4.廣西醫科大學廣西地中海貧血防治重點實驗室，南寧 530021）

α 珠蛋白三聯體是一種多拷貝變異體，可以通過基因的劑量效應影響地中海貧血的表型，由16號染色體α珠蛋白基因簇的同源序列發生不等交換時產生，主要包括兩種類型：αααanti3.7和αααanti4.2。當重組發生于X同源盒時，可使一條16號染色體缺失了4.2 kb（-α4.2），另一條染色體則形成α-珠蛋白三聯體（αααanti4.2）；當重組發生在Z 同源盒時，則分別形成3.7 kb缺失（-α3.7）和另一種α-珠蛋白三聯體（αααanti3.7）[1]。當α珠蛋白三聯體αααanti4.2與-α3.7發生不等交換時可形成HKαα，又稱香港型地中海貧血[2]。HKαα基因由α2基因、X1與X2形成的融合基因以及由α2與α1形成的融合基因（-α3.7）三部分組成，是一種罕見的α地貧重組基因[3]。臨床常用的常規缺失型α地中海貧血基因檢測試劑盒無法檢測出HKαα，易發生漏診和誤診。目前國內、外關于HKαα 的報道多為HKαα/αα 及HKαα 復合東南亞型缺失α 地中海貧血（HKαα/--SEA）。本文報道罕見的HKαα 復合-α4.2 缺失型α 地中海貧血（HKαα/-α4.2）病例的臨床和血液學特征，以期為臨床診療和遺傳咨詢提供依據。

1 對象和方法

1.1 研究對象

收集2021 年5 月至2022 年3 月在廣西醫科大學第一附屬醫院進行地中海貧血檢測的165 例患者，其中-α3.7 和-α4.2 缺失型α 地中海貧血雜合子90 例，--SEA/-α3.7及--SEA/-α4.2缺失型Hb H 病75 例。165例中，男59例，女106例，年齡1個月至89歲。

1.2 血常規分析

采集靜脈血2 mL，收集于含有乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝管中。用血細胞自動分析儀（CELL-DYN1700，雅培公司，美國）對樣本進行血常規檢測，包括紅細胞計數（RBC）、血紅蛋白（Hb）、紅細胞平均容積（MCV）、紅細胞平均血紅蛋白（MCH）、紅細胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血細胞比容（HCT）、紅細胞體積分布寬度（RDW）等。

1.3 Hb分析

采用高效液相色譜儀（Hb Variant Ⅱ，Bio-Rad,美國）對全血中的Hb H、Hb A2、Hb F進行定量分析。

1.4 DNA提取

用核酸自動提取儀（Lab-Aid 820，廈門百維信生物科技有限公司）應用磁珠法基因組DNA提取技術從外周靜脈血中提取DNA。提取的DNA經紫外分光光度計（Nanodrop 2000/2000CC，賽默飛公司,美國）測定樣本濃度和純度合格后，裝于1.5 mL 離心管中于-20 ℃冰箱保存。

1.5 α地中海貧血基因突變分析

1.5.1 常見的缺失型α-地中海貧血基因突變檢測

采用跨越斷裂點聚合酶鏈反應（Gap-PCR）技術檢測4 種常見的缺失型α-地中海貧血基因突變：--SEA、-α3.7、-α4.2、--THAI（缺失型α-地中海貧血基因診斷試劑盒，深圳市億立方生物技術公司）。PCR擴增：在21 μL PCR反應液中加入3 μL DNA樣本及1 μL 雙蒸餾水，構成25 μL 的反應體系。PCR 反應條件：經50 ℃預熱5 min，96 ℃預變性5 min 后；98 ℃變性45 s，64 ℃退火90 s，72 ℃延伸3 min，共35 個循環；最后72 ℃繼續延伸10 min（PROFLEX BASE，LifeTechnologies，美國）。PCR 反應產物經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳50 min 后在凝膠成像系統（GeldocXR+，Bio-Rad，美國）上拍照、記錄。

1.5.2 常見的非缺失型α-地中海貧血基因突變檢測

采用熒光PCR 熔解曲線法（FCMA）檢測α-地貧3種常見的非缺失型α-地中海貧血基因突變：Hb CS、Hb QS、Hb WS（非缺失型α-地中海貧血基因診斷試劑盒，廈門致善生物科技公司）。采用FCMA技術在全自動醫用PCR分析系統（SLAN-96S，上海宏石醫療科技公司）擴增。在19.8 μL PCR 反應液中加入5 μL DNA 樣本及0.2 μL 酶混合液，構成25 μL的反應體系。PCR反應程序：經50 ℃UNG酶處理2 min，95 ℃預變性10 min后；95 ℃30 s，70 ℃15 s（每個循環下降1 ℃），76 ℃20 s，共10個降落循環；95 ℃15 s，55 ℃15 s，76 ℃20 s，共50個PCR循環。嚴格按說明書對實驗結果進行判讀。

1.5.3 αααanti4.2基因檢測 引物設計按參考文獻[4]。共有兩對引物，一對引物用于擴增X1/X2融合片段：AT4.2-F、AT4.2-R；另一對引物用于擴增位于非翻譯區的LIS1基因：LIS1-2.5。X1/X2 融合片段的上游引物AT4.2：5’-CCTTGCACCGGCCCTTCCTG-3’，下游引物AT4.2：5’-GAACTGGCTGAAAGGGATGCAG-3’；LIS1基因的上游引物LIS1-2.5：5’-GTCGTCACTGGCAGCGTAGATC-3’，下游引物LIS1-2.5：5’-GATTCCAGGTTGTAGACGGACTG-3’（引物由上海生物工程技術有限公司合成）。應用Gap-PCR 在PCR 擴增儀上（PROFLEX BASE，LifeTechnologies，美國）擴增。PCR 反應體系：200 μmol/Ld NTP、1.5 mmol/L MgCl2、2.5 U TaqDNA 聚合酶、200 ng DNA 樣本、0.5 μmol/L 引物、PCR 反應緩沖液。PCR 反應條件：96 ℃預變性15 min；98 ℃變性45 s，60 ℃退火90 s，72 ℃延伸135 s，共30個循環；72 ℃繼續延伸5 min[5]。經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳30 min后在凝膠成像系統（GeldocXR+，Bio-Rad，美國）上拍照、記錄。

1.6 β地中海貧血基因突變分析

采用熒光PCR 熔解曲線法（FCMA）檢測21 種常見β-地貧的非缺失型基因突變：c.-78A＞G、c.-79A＞G、c.-80T＞C、c.-81A＞C、c.-82C＞A、c.-123A＞T、c.-140C＞T、c.45_46insG、c.48_49insG、C.52A＞T、c.79G＞A、c.91A＞G、c.92+1G＞T、c.92+5G＞C、c.84_85insC、c.113G＞A、c.216_217insA、c.130G＞T、c.315+5G＞C、c.316-197C＞T、c.124_127delTTCT（β-地貧基因診斷試劑盒，廈門致善生物科技公司）。采用FCMA技術在全自動醫用PCR分析系統（SLAN-96S，上海宏石醫療科技公司）擴增。在19.8 μL HBB PCR Mix A/B 反應液中加入0.2 μL HBB酶混合液及5 μL DNA 樣本，構成25 μL的反應體系。PCR 反應程序：經50 ℃預熱5 min，95 ℃預變性10 min 后；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，76 ℃延伸20 s，共55 個循環。嚴格按說明書對實驗結果進行判讀。

2 結果

2.1 病例一般資料

在165例樣本中檢出1例基因型為HKαα/-α4.2，5 例基因型為HKαα 的患者。6 例患者均來自廣西壯族自治區，HKαα/-α4.2患者為35 歲男性，5 例HKαα患者年齡25～32歲，患者均無貧血表現，無黃疸、肝脾腫大或輸血史。-α3.7 和-α4.2 缺失型α 地中海貧血突變樣本中的檢出率均為3.03%。

2.2 血常規

基因型為HKαα/-α4.2的患者血常規結果：RBC 5.59×1012/L，Hb 166 g/L，MCV 88.60 fL，MCH 29.70 pg，MCHC 335.00 g/L?；蛐蜑镠Kαα的5例患者血常規結果：RBC（4.77±0.26）×1012/L，Hb（135.68±4.37 ）g/L，MCV（86.25±4.05）fL，MCH（28.47±1.12）pg，MCHC（330.48±3.75）g/L。參數正常參考值范圍：RBC（4.3～5.8）×1012/L，Hb 130～175 g/L，MCV 82.0～100.0 fL，MCH 27.0～34.0 pg，MCHC 316～354 g/L。

2.3 血紅蛋白分析

Hb 分析顯示，HKαα/-α4.2的患者：Hb A22.6%，Hb F 1.5%，未見異常Hb。5例基因型為HKαα的患者：Hb A2（2.84±0.05）%，Hb F（0.36±0.11）%，未見異常Hb。參數正常參考值范圍：Hb A22.5%～3.5%，Hb F 0.0%～1.0%。

2.4 基因分析結果

2.4.1 缺失型α-地中海貧血基因突變檢測結果

常見的非缺失型α-地中海貧血基因突變檢測：檢出67 例-α3.7 缺失型α 地中海貧血，16 例-α4.2 缺失型α地中海貧血，7例-α3.7缺失型復合-α4.2缺失型α 地中海貧血和75 例HbH 病（44 例--SEA/-α3.7，31例--SEA/-α4.2）。

HKαα/-α4.2的病例擴增出2.0 kb-α3.7缺失型突變，1.4 kb-α4.2基因突變，及1.7 kb αα；HKαα的病例擴增出2.0 kb-α3.7缺失型突變，及1.7 kb αα，結果見圖1。

圖1 Gap-PCR法檢測缺失型α地中海貧血

2.4.2 非缺失型α-地中海貧血基因突變檢測結果

所有病例均未檢出Hb CS、Hb QS 和Hb WS 等非缺失型突變。

2.4.3 αααanti4.2基因檢測結果 共檢出6 例αααanti4.2病例，PCR 擴增產物顯示1.7 kb αααanti4.2基因片段，及2.5 kb的正常α珠蛋白基因片段，見圖2。

圖2 αααanti4.2 PCR檢測結果

2.4.4 β-地中海貧血基因突變檢測結果

所有病例均未檢測出β-地中海貧血基因突變。

3 討論

α 地中海貧血是遺傳性疾病，是一種由α 珠蛋白基因的缺陷導致血紅蛋白中的α珠蛋白肽鏈合成減少甚至完全不能合成而形成的遺傳性溶血性貧血。人類的α 珠蛋白基因簇位于16 號染色體的短臂末端（16p13.3）,每一條染色體各有2 個α 珠蛋白基因，一對染色體則共有4 個α 珠蛋白基因。α-珠蛋白基因簇的同源區段有X、Y、Z 盒，其中2 個Z 同源盒的間距為3.7 kb，2 個X 同源盒的間距為4.2 kb。當重組發生于Z 同源盒可形成α-珠蛋白三聯體（αααanti3.7）。當重組發生于X 同源盒可形成另一種α-珠蛋白三聯體（αααanti4.2）[4]。這兩種三聯體最早于1980年被報道[6]。因為基因數目在地中海貧血的表型調控中起著重要作用，α-珠蛋白三聯體可以通過基因效應影響地中海貧血患者的表型。

HKαα為α珠蛋白三聯體αααanti4.2與-α3.7發生不等交換時形成[7]。在廣西地區人群中HKαα的攜帶率為0.16%[8]。與-α3.7相比，因為-α3.7只有一個α2與α1形成的融合基因，HKαα 除含有一個α2與α1形成的融合基因外，還有一個完整的α2基因。因此，HKαα 血液學表型優于-α3.7攜帶者[9]。目前關于HKαα的報道，被描述較多的為HKαα/αα及HKαα復合東南亞型缺失（HKαα/--SEA）。基因型為HKαα/αα 的個體多無貧血，血液學檢測正常[9]?；蛐蜑镠Kαα/--SEA的患者臨床表型和--SEA/αα 極為相似，比HbH?。?α3.7/--SEA）癥狀輕[10-12]。

本研究在165 例含-α3.7 或-α4.2 缺失型α 地中海貧血突變的雜合子或Hb H病病例中，共檢出5例HKαα 患者，檢出率為3.03%，其血常規結果顯示：RBC（4.77±0.26）×1012/L，Hb（135.68±4.37）g/L，MCV（86.25 ± 4.05）fL，MCH（28.47 ± 1.12）pg，MCHC（330.48±3.75）g/L。Hb 分析顯示：Hb A2（2.84±0.05）%，Hb F（0.36±0.11）%。血液學檢測各及血紅蛋白分析各項指標正常，這一結果與以往姚亞超等[10]和Wu等[12]報道的結果相似。

HKαα/-α4.2地中海貧血病例較為罕見，目前國內、外僅報道8 例，其中6 例均有輕度貧血或MCV、MCH 降低，2 例病例無臨床表現和血液學檢查結果。如2015 年Wu 等[13]報道1 例28 歲基因型為HKαα/-α4.2的女性患者，血常規檢測：Hb 136 g/L，MCV 78.30 fL，MCH 25.10 pg，Hb分析中HbA22.2%、Hb A2略降低，MCV、MCH低于正常值。2019年Wang 等[14]在廣西桂林地區發現2 例基因型為HKαα/-α4.2的病例，其中1例9歲患者的血液學常規檢測結果為Hb 126 g/L，MCV 74.20 fL，MCH 24.60 pg，Hb分析中Hb A22.9%。其MCV及MCH低于正常值。另一例為胎兒。2020 年劉沃滿等[15]報道茂名地區3 例HKαα/-α4.2患者，血常規檢測顯示患者為輕度貧血[Hb（106.00±9.90）g/L，MCV（88.2±7.3）fL，MCH（28.2±2.4）pg]，Hb分析中HbA2（2.4±0.1）%。2021 年Long 等[8]在廣西欽州地區發現了一例HKαα/-α4.2患者，未描述臨床癥狀及血液學常規檢測結果。

本研究的HKαα/-α4.2病例與上述文獻HKαα/-α4.2的病例有輕度貧血或MCV、MCH降低等臨床特征不同，為首個臨床表現及血液學各項指標均正常的HKαα/-α4.2病例。但因病例較罕見，病例數較少，因此該基因型對臨床及血液學特征等的影響有待更多的病例進行研究。

綜上，本研究首次發現HKαα/-α4.2患者無貧血癥狀，血液學檢測正常，這與既往文獻報道不同，這些發現有助于臨床診療和遺傳咨詢。