γ 珠蛋白基因Aγ-225～-222缺失突變復合重型β-地中海貧血的臨床特征分析*

李藺芝，林偉雄，肖 璇，李樹全，陳 萍△

（1.廣西醫科大學生命科學研究院，南寧 530021；2.國家衛生健康委地中海貧血防治重點實驗室；3.中國醫學科學院地中海貧血防治研究重點實驗室，南寧 530021；4.廣西醫科大學地中海貧血防治重點實驗室，南寧 530021）

非缺失型遺傳性持續性胎兒血紅蛋白綜合征（ndHPFH）是由于γ 珠蛋白基因啟動子序列發生的點突變或小片段缺失而導致的一種遺傳性血紅蛋白病。胎兒血紅蛋白（Hb F）是由兩條α和兩條γ珠蛋白鏈組成的四聚體蛋白質（α2γ2），其中γ珠蛋白鏈由位于11 號染色體上的β-珠蛋白基因簇中的Aγ和Gγ 珠蛋白基因表達[1]。γ 珠蛋白基因啟動子區的點突變或小片段缺失會導致γ 珠蛋白鏈的合成增加，Hb F持續增高，致使成年后仍表達。正常情況下新生兒臍帶血中Hb F約占70%，出生時γ珠蛋白基因關閉、β-珠蛋白基因表達逐漸增加，使Hb F 迅速減少，至6 個月時不超過5%，2 歲時不超過1%[2]。Hb F 的持續合成可以恢復α/non-α 珠蛋白比率，降低血紅蛋白病如β-地中海貧血、鐮狀細胞貧血的無效紅細胞生成并改善疾病嚴重程度[3]。ndHPFH 病例一般具備正常人的血液學表型和臨床表型，臨床上ndHPFH復合重型β-地中海貧血的病例較少，大多表現為中間型β-地中海貧血的血液學表型，臨床表型減輕，根據基因型的不同，血液學表型具有較大異質性[4]。本研究旨在分析廣西地區Aγ-225～-222 復合重型β-地中海貧血的基因型、血液學表型情況，探究其對重型β-地中海貧血的影響，為地中海貧血的臨床診療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020 年7 月至2022 年1 月在廣西醫科大學第一附屬醫院門診診斷為地中海貧血且Hb F水平≥5%的患者300例，其中男153例，女147 例，年齡1 個月至73 歲。另從門診抽取30 例體檢健康者的DNA 測序作對照，其中男13 例，女17例，年齡1個月至59歲。

1.2 血常規分析 采用血細胞自動分析儀（美國Abbott 公司，CELL-DYN 1700）進行血常規分析，收集紅細胞計數（RBC）、血紅蛋白（Hb）、平均紅細胞體積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白（MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）等數據。

1.3 Hb 分析 患者的Hb A、Hb A2、Hb F 的定量水平檢測用高效液相色譜法（HPLC）（HbVariantTMⅡ，美國Bio-Rad公司）進行。

1.4 抗凝全血樣本DNA 的提取 采用自動核酸提取儀（Lab-Aid 820，廈門百維信生物科技有限公司）提取DNA，微量紫外分光光度計（NanoDrop ND-8000，美國Thermo公司）檢測DNA濃度及純度。

1.5 γ珠蛋白基因突變分析（1）引物設計：引物設計參考文獻[5]，引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。兩對引物分別擴增Aγ、Gγ 珠蛋白啟動子基因。Aγ 珠蛋白基因上游引物:5’-GCGCTGAAACTGTGGCTTTAT-3’，Gγ 珠蛋白基因上游引物:5’-GCACTGAAACTGTTGCTTTATAGGA-3’，兩者共有的下游引物：5’-GGCGTCTGGACTAGGAGCTTATTG-3’；（2）聚合酶鏈式反應（PCR）：PCR反應體系為2×GC BufferI 25μL，雙蒸水13μL,dNTP Mixture 8μL，DNA2μL，TAKARALA Taq酶0.3μL，上、下游引物（AF+R 或GF+R）各1μL。以上試劑由大連寶生物工程有限公司提供。PCR 反應條件為95 ℃預變性3 min；94 ℃變性40 s，60 ℃45 s，72 ℃2 min，共30 個循環；72 ℃延伸5 min。PCR 產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳后再凝膠成像系統（UVI FireReader,英國UVItec 公司）上觀察并記錄；（3）DNA測序：由華大基因對PCR 產物測序，將序列測定結果與30 例體檢健康者的基因序對比，再使用Chromas軟件分析。

1.6 地中海貧血基因突變分析（1）β-地中海貧血、非缺失型α-地中海貧血基因突變分析：熒光PCR 熔解曲線法（FCMA）篩查β-地中海貧血基因突變、非缺失型α-地中海貧血基因突變（β-地中海貧血基因檢測試劑盒，非缺失型α-地中海貧血基因檢測試劑盒，廈門致善生物科技有限公司）；（2）缺失型α-地中海貧血基因突變分析：跨越斷裂點聚合酶鏈式反應（Gap-PCR）法檢測（--SEA，--α3.7，--α4.2，--THAI）缺失型α-地中海貧血基因突變（缺失型α-地中海貧血基因檢測試劑盒，深圳市億立方生物技術有限公司）。

2 結果

2.1 一般資料 300 例Hb F 水平≥5%的患者中，共檢出16 例Aγ-225～-222 缺失突變復合重型β-地中海貧血。16 例中，男9 例，女7 例，年齡2～57 歲，其中18 歲以下11 例（2～17 歲），成人5 例。其中病例1、2、3、4、5、6、7、12 無輸血史，病例8、9、10、11、13、14、15、16有輸血史。

2.2 血常規檢測結果 16 例Aγ-225～-222 缺失突變復合重型β-地中海貧血，輕度貧血7 例，Hb 90～111.9 g/L、MCV 65.9～80.31 fL、MCH 20.22～28.06 pg；中度貧血7 例，Hb 60.7～87 g/L，MCV 62.9～86.24 fL，MCH 19.4～27.21 pg；重度貧血2 例，Hb 47.3 g/L、55.5 g/L，MCV 77.31 fL、75.26 fL，MCH 24.8 pg、24.49 pg，結果見表1。

2.3 Hb 分析結果 16 例Aγ-225～-222 缺失突變復合重型β-地中海貧血的Hb F 水平均升高，為8.6%～85.6%，Hb A2正常或升高，為2.6%～9.3%，結果見表1。

2.4 γ 珠蛋白基因突變結果 對300 例DNA 樣本進行了Aγ 和Gγ 珠蛋白基因啟動子區域DNA 測序。經DNA 測序共檢出16 例Aγ-225～-222AGCA 缺失突變復合重型β-地中海貧血，其中11例為Aγ-225～-222AGCA 缺失雜合子，5 例為Aγ-225～-222AGCA缺失純合子，并抽取30 例體檢健康者的DNA 測序峰圖作對照，見圖1。

圖1 Aγ珠蛋白基因啟動子區域的DNA測序結果

2.5 β-地中海貧血基因突變結果 共檢出Aγ-225～-222缺失突變復合β-地中海貧血雙重雜合子或純合子16 例，其中12 例為β0/β+：βCD41-42/β-287 例，βCD17/β-283 例，βIVS-I-1/β-281 例，βCD71-72/β-281 例；3 例為β+/β+：β-28/β-282例，βIVS-II-654/β-281例；1例為β0/β0，基因型為βCD41-42/βCD17，結果見表1。

表1 Aγ-225～-222缺失突變復合重型β-地中海貧血的血常規、血紅蛋白、基因型分析結果

2.6 α-地中海貧血基因突變結果 未檢出α-地中海貧血基因突變。

3 討論

ndHPFH可以分為Aγ-ndHPFH、Gγ-ndHPFH和AγGγ-ndHPFH[6]。目前已報道的ndHPFH主 要有Aγ-196C＞T、Aγ-158C＞T、Aγ-226～-223 缺失、Aγ-225～-222 缺失和Aγ-158C＞T、Gγ-158C＞T 等[7]，但關于ndHPFH復合地中海貧血的報道較少。

Aγ-225～-222 缺失突變屬于Aγ-ndHPFH，是Aγ珠蛋白基因啟動子區域-225～-222位點上的4個堿基AGCA發生缺失而導致的突變，Aγ-225～-222AGCA 的缺失會產生額外的轉錄因子結合位點，這些位點結合轉錄γ 珠蛋白基因表達的阻遏子GATA1，從而降低Aγ珠蛋白基因啟動子的活性，導致Gγ/Aγ比例增高[8]。Aγ-225～-222 缺失突變會導致Hb F 水平增高。Winichagoon 等[9]在泰國人中發現1例Aγ-225～-222缺失雜合子復合Gγ-158C＞T突變雜合子，Hb F 升高（19.4%）。朱恒瑩等[10]發現3 例Aγ-225～-222 缺失雜合子，Hb F 升高（4.0%～9.1%），Hb F 增高程度與Winichagoon等[9]發現的略有不符，提示Aγ-225～-222缺失突變對Hb F的影響在不同人群中可能存在差異。

Gilman 等[11]在一名美國黑人中發現Aγ-225～-222缺失突變合并β0-地中海貧血雜合子，并帶有異常血紅蛋白C，Hb F 為6.7%。朱恒瑩等[10]發現2例Aγ-225～-222缺失雜合子復合β-地中海貧血雜合子，基因型表現為βCD17/βN、β-28/βN，Hb正常，與單純雜合子組（βCD17/βN、β-28/βN）相比，Hb F、Hb 水平明顯升高。上述研究提示，當Aγ-225～-222 缺失突變復合β-地中海貧血雜合子時，會使Hb F、Hb 升高，改善其貧血程度。

目前國內、外未見關于Aγ-225～-222 缺失突變影響重型β-地中海貧血臨床特征的報道。本課題組王維東等[12]分析了21 例ndHPFH 復合β-地中海貧血雙重雜合子或純合子，血紅蛋白分析顯示Hb F水平明顯增高，一些血液學參數如RBC、Hb、HCT等也升高，貧血程度得到改善，但并未對ndHPFH突變類型影響重型β-地中海貧血的臨床特征包括血液學等進行詳細分析。

本研究共發現16例Aγ-225～-222缺失突變復合重型β-地中海貧血病例。病例的β-地中海貧血基因型：βCD41-42/β-287 例、βCD17/β-283 例、β-28/β-282 例及βCD71-72/β-28、βIVS-I-1/β-28、βCD41-42/βCD17、βIVS-II-654/β-28各1 例。16例病例中，臨床表現輕度貧血的7例，中度貧血7例，重度貧血2例。上述病例共有14例表現為輕至中度貧血，其貧血程度相較于一般重型β-地中海貧血患者明顯減輕，一般重型β-地中海貧患者的臨床表現為重度貧血，Hb 明顯下降（20～60 g/L），需定期輸血來維持生命[13]，本研究發現的Aγ-225～-222缺失突變復合重型β-地中海貧血病例中有14 例表現為輕至中度貧血，其中有8例無需輸血，其貧血程度相較于一般重型β-地中海貧血患者明顯減輕，僅有2 例表現為重度貧血，其中1 例患者同時患有脾功能亢進，推測可能存在脾大、骨髓增生異常等其他因素的影響。關于Aγ-225～-222缺失突變對重型β-地中海貧血的影響還需更多的病例來驗證。

既往研究表明，當重型β-地中海貧血患者合并ndHPFH時其貧血程度較輕[14]，如Gγ-158C＞T突變合并重型β-地中海貧血的患者多無輸血史[15]，臨床表現為輕度或中度貧血。本研究大部分合并重型β-地中海貧血患者的貧血程度多有改善，與其他類型ndHPFH 改善重型β-地中海貧血的貧血程度相似，其分子機制可能是ndHPFH 的γ 珠蛋白基因啟動子發生突變，從而使γ珠蛋白鏈合成增加，減輕重型β-地中海貧血中α-鏈/非α-鏈比例不平衡對其產生的影響，使Hb水平維持在輕度到中度之間，減少其輸血次數、甚至不需輸血[16]。

當重型β-地中海貧血患者合并α-地中海貧血時也能改善其貧血程度，但本研究的病例沒有合并α-地中海貧血，因此排除了α-地中海貧血導致其貧血程度改善的可能性。

本研究發現Aγ-225～-222缺失突變可改善重型β-地中海貧血患者的臨床貧血程度，這些研究可為臨床診療，遺傳咨詢和產前診斷提供依據。