超高效液相色譜-串聯質譜法測定豆芽中4-氯苯氧乙酸的不確定度評定

◎ 楊麗英，吳 燕，李曉頎，楊世波，張滿常

（云南省保山市食品藥品檢驗檢測中心，云南 保山 678000）

豆芽屬于無季節性食品，價格便宜且含有多種營養成分，深受廣大消費者喜愛[1]。在生產中，為提高豆芽產量常使用4-氯苯氧乙酸，4-氯苯氧乙酸常被用作植物生長調節劑，具有增快生長速度、促進植物成熟的作用[2-4]。但有研究表明，4-氯苯氧乙酸對小鼠的肝臟、腎臟以及成熟精細胞具有毒性作用，因此相關法律規定豆芽制作及銷售過程中禁止使用4-氯苯氧乙酸[5-6]。但目前4-氯苯氧乙酸的檢出率仍然很高，所以對它的測定及其結果的準確性研究是必要的[7-8]。不確定度的數值是反映測量結果的精確度的指標，值越小表明測量結果與真實值越接近，結果越精確。在食品檢測領域，不確定度的評定既能提高分析檢測質量，又能達到檢測結果準確度高的目的。本文根據《測定不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[9]，結合《豆芽中植物生長調節劑的測定》（BJS 201703）[10]對豆芽中4-氯苯氧乙酸的不確定度進行評定，以期為檢測結果的準確性提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters XEVOTQ-S MICRO超高效液相色譜串聯四極桿質譜聯用儀（美國沃特世公司）；梅特勒MS205DU萬分之一精密天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；NV-15G氮氣吹干儀（天津博納艾杰爾科技有限公司）；渦旋混合器（上海精科實業有限公司）。

4-氯苯氧乙酸標準物質，批號：AL171216-10，純度＞98%；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）：粒徑范圍為40～60 μm；無水硫酸鎂；無水乙酸鈉。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取4-氯苯氧乙酸標準品13.94 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度為139.4 μg·mL-1的標準儲備液，移取該儲備液1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度為13.94 μg·mL-1的標準中間1號溶液。移取標準儲備液1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度為1.394 μg·mL-1的標準中間2號溶液。分別精密量取標準中間溶液（1.394 μg·mL-1）10 μL、20 μL、30 μL、40 μL 和 50 μL及 標 準 中 間 液（13.94 μg·mL-1）10 μL、20 μL， 用空白基質提取液定容至1.0 mL，得到基質標準工作溶液。

1.3 樣品的前處理

1.3.1 樣品溶液的提取

稱取充分混勻的試樣10.0 g（精確至0.001 g）于50 mL具塞離心管中，加入0.1%甲酸酸化的乙腈溶液20 mL，旋渦混勻2 min，再加入4 g無水硫酸鎂和1 g無水乙酸鈉，立即渦旋混合1 min，以10 000 r·min-1離心5 min使乙腈和水相分離，吸取全部上清液至50 mL容量瓶，樣品殘渣再次加入0.1%甲酸的乙腈溶液20 mL重復上述操作，合并上清液于上一個容量瓶中并用0.1%甲酸的乙腈定容至刻度。

1.3.2 樣品溶液的凈化

精密移取上清液4 mL置于裝有300 mg無水硫酸鎂和100 mg C18的QuEChERS離心管中，旋渦混合2 min，以10 000 r·min-1離心5 min，移取全部上清液于10 mL離心管中，氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，渦旋混勻1 min，上清液經0.22 μm有機相濾膜過濾后，供超高效液相色譜-串聯質譜測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：甲醇，0.1%甲酸水40∶60（體積比）；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣量：1.0 μL。

1.4.2 質譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI源），正離子掃描模式（ESI+），采用多反應監測模式掃描（Multiple Reaction Monitoring，MRM），離子源溫度為150 ℃、毛細管電壓為2.0 kV，碰撞能量及定性定量離子質譜參數如表1所示。

表1 4-氯苯氧乙酸質譜參數表

2 結果與分析

2.1 不確定度的來源分析

從測量過程和被測量的數學模型分析，各相關不確定如圖1所示。

圖1 不確定度分量的來源圖

2.2 標準溶液配制引入的不確定度

2.2.1 原始標準物質引入的不確定度

氯苯氧乙酸標準物質來源Stanford Analytical Chemicals Inc.、純度98%及擴展不確定度0.5%，按正態分布考慮，k=2，確定為B類評定，得到標準不確定度及相對標準不確定度的值為：

2.2.2 稱量引入的不確定度

4-氯苯氧乙酸標準品稱取質量為0.010 00 g，使用分度值為0.01 mg的分析天平，擴展不確定度為0.15 mg，k=2，為B類評定。得到標準不確定度及相對標準不確定度的值為：

2.2.3 標準溶液配制步驟中量具校準引入的不確定度

標準溶液配制步驟中使用的玻璃量具，參照《常用玻璃量具檢定規程》（JJG 196—2006）的要求，有對應的最大允差，按矩形分布考慮為B類評定，由此計算各量具的不確定度分量（表2）。

由表2中數據合成的標準溶液配制步驟中玻璃量具引入的不確定度為：

表2 標準溶液配制步驟中量具校準引入的不確定度表

2.2.4 標準溶液配制步驟中溫度波動引入的不確定度

玻璃量具的校正溫度一般為T校正=20 ℃，而實驗在（23±0.5）℃下完成，此溫度下產生的不確定度可根據估算溫度范圍和體積膨脹系數來計算，溶劑以甲醇為代表，甲醇的膨脹系數為1.2×10-3℃-1，玻璃的膨脹系數為9.75×10-6℃-1(可忽略不計)。按矩形分布考慮，其結果如表3所示。

由表3中數據合成的標準溶液配制步驟中溫度波動引入的不確定度為：

表3 標準溶液配制步驟中溫度波動引入的不確定度表

綜上，標準系列溶液的配制的合成不確定度為：

2.3 標準曲線擬合引入的不確定度

4-氯苯氧乙酸濃度X是工作曲線回歸計算得出，由實驗計算得出，回歸方程Y=mX+b（Y為色譜峰峰面積，X為4-氯苯氧乙酸濃度，μg·mL-1），本次實驗的標準回歸方程為Y=113 956X-570.61，R2=0.999 1。具體數據結果見表4。S與SXx的計算結果如下：

表4 標準工作曲線相關系數表

則標準曲線擬合引入的不確定度為：

式中：S=240.31；SXx=0.051 5；m為斜率，m=113 956；b為截距，b=-570.61；p為樣品測量次數，p=2；n為標準曲線各點測量總次數，n=14；x為各標準溶液中4- 氯苯氧乙酸濃度的平均值，x=0.089 61 μg·mL-1；X為樣品測定溶液中4-氯苯氧乙酸濃度平均值，X=0.019 32 μg·mL-1；Xi為濃度值，μg·mL-1；Yi為色譜峰峰面積。

2.4 樣品制備過程引入的不確定度

2.4.1 樣品稱量引入的不確定度

稱量試樣豆芽10.193 8 g、10.141 7 g，使用分度值為0.01 g的分析天平，擴展不確定度為0.03 g，k=2，確定為B類評定。其標準不確定度及相對標準不確定度為：

2.4.2 樣品提取、凈化引入的不確定度

樣品制備過程中使用的玻璃量具，參照《常用玻璃量具檢定規程》（JJG 196—2006）的要求，有對應的最大允差，按照矩形分布考慮，由此估算各量具的不確定度分量（表5）。

由表5中數據合成的樣品制備過程量具引入的不確定度為：

表5 樣品制備過程中玻璃量具引入的不確定度表

因此，樣品處理引入的合成不確定度為：

2.5 回收率引入的不確定度

考察回收率是對樣品前處理過程引入的不確定度最有效的評定方法之一。因此，對樣品進行加標回收試驗，并對加標的樣品進行測定，兩次平行回收率分別為99.34%、97.07%，平均回收率為98.20%。

參照公式：重復性+證書標準值，回收率的不確定度公式為：

式中：urel(Rc)為回收率的不確定度；為回收率的平均值，%；s(R)為回收率的標準差；n為回收率的個數；u(Xs)為標準物質的不確定度來源于標準物質證書；Xs為標準值濃度來源于標準物質證書。

2.6 樣品重復測定的相對標準不確定度評定

同一操作人員在相同條件下對同一標樣進行6次測定，4-氯苯氧乙酸的峰面積分別為6 929.527、6 977.877、6 942.843、6 938.554、6 951.440 和6 996.335，為A類評定，計算公式為：

2.7 標準不確定度報告及結果表示

2.7.1 相對標準合成不確定度

相對標準不確定度來源及分量見表6。相對標準合成不確定度為：

表6 相對標準不確定度分量表

2.7.2 擴展不確定度

查閱《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[9]的相關規定，按95%的置信概率，包含因子k=2，則4-氯苯氧乙酸含量的擴展不確定度為

2.7.3 不確定度報告

試樣中4-氯苯氧乙酸的含量為23.7 mg·kg-1，標準要求保留3位有效數字，所以豆芽中4-氯苯氧乙酸含量不確定度為（23.7±0.805 8）mg·kg-1，包含因子k=2。

3 結論

本研究采用了液質聯用法測定豆芽中植物生長調節劑4-氯苯氧乙酸的不確定度評定，分析結果顯示回收率的測定對不確定度的影響最大，因此在日常檢測過程中可通過增加樣品加標重復性測定等措施，以降低檢測結果的不確定度；標準曲線法測定對不確定度的影響次之，在今后的檢驗工作，要控制實驗室檢測環境溫度，盡量使用精度較高的稱量工具及準確度等級較高的標準品和器皿來配制標準溶液。