酸棗仁湯對抑郁模型大鼠海馬DKK-1與β-catenin、GSK-3β的影響*

張 浩，孫田昊澤，張 策，劉沐垚，張小芳，王超穎，田旭升

(黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040)

抑郁癥(depression)又稱抑郁障礙，以顯著而持久的心境低落、精力下降、勞累負荷重和活動減少為主要臨床癥狀，其發病率、致殘率、復發率高且多伴有自殺傾向，是一類嚴重的精神障礙性疾病。據報道，全球抑郁癥患者已達到3億5千萬[1]。該病發生發展與社會、心理因素和生物遺傳關系密切，致病機理有多種假說，臨床常用選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors,SSRIs)與選擇性去甲腎上腺素再吸收抑制劑(selective noradrenalin reuptake inhibitors,SNRIs)進行治療，療效尚可。目前抑郁癥的治療多采用西藥，但不良反應較大[2]。近年來，中醫藥治療抑郁的效果與優勢逐漸凸顯，課題組選用酸棗仁湯治療虛煩不寐型抑郁癥，效果較好。酸棗仁湯出自《金匱要略》，用于治療“虛勞虛煩不得眠”，為養血安神、清熱除煩之經典方劑[3]。

神經可塑性假說認為，情緒腦區神經發生減少和/或神經元退行性變的增加是導致抑郁癥發生的關鍵[4]。臨床研究結果顯示，與正常人比較，抑郁癥患者的海馬體積顯著減少，且海馬神經元出現壞死和萎縮[5，6]，故海馬神經元再生障礙是抑郁癥發生的重要病理機制之一[7]。研究表明，重組人Dick-kopf相關蛋白-1(dickkopf-1,DKK-1)在一定條件下可以影響神經元、神經膠質細胞以及神經元內信號傳導通路；β-連環蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)在腦組織尤其是海馬中呈高表達，參與神經發生、突觸可塑性及穩態的調控等過程[8]。本研究建立大鼠慢性不可預見性應激抑郁模型(chronic unpredictable mild stress,CUMS)，通過觀察酸棗仁湯對抑郁模型大鼠海馬組織DKK-1、β-catenin與GSK-3β的影響，探討其抗抑郁機制是否與神經保護作用有關。本研究通過黑龍江中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準(批準號2015121002)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級48只SD雄性大鼠，體質量(180±20) g，購于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物許可證號SCXK(黑)2014-0008。飼養于室溫20～25 ℃、自由攝食飲水、12 h明暗周期環境下適應性循環。

1.2 藥物

酸棗仁湯組成：酸棗仁20 g，茯苓10 g，知母10 g，甘草5 g，川芎10 g，其劑量主要參考《金匱要略》，方中所需中藥飲片均購于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院藥局，按照常規方法搗碎浸泡40 min后熬制2次，藥液合并過濾，具體換算方法參照參考文獻[9]。酸棗仁湯水煎劑人用劑量為55 g / (kg·d)，根據大鼠與人的體表面積換算法得到大鼠服用中劑量為55×0.018×5≈5 g /(kg·d)，此劑量屬于臨床等效劑量，即酸棗仁湯低、中、高劑量分別為2.5、5、10 g /kg，分別相當于臨床等效劑量的1 /2 、1、2 倍。氟西汀(法國禮來蘇州制藥有限公司，國藥準字J20080016，每片20 mg，成人用藥劑量20 mg～60 mg)的大鼠臨床等效藥量為0.04×0.018×5≈0.0036 g/(kg·d)。

1.3 主要試劑及儀器

DKK-1兔抗多克隆抗體(貨號AF2056)與二抗(貨號A0208)，由上海碧云天生物技術有限公司提供；β-catenin、GSK-3β、β-actin引物均由上海碧云天生物技術有限公司設計并合成。

石蠟切片機(2136型，萊卡)；顯微攝影成像系統(moticam3000型，麥克奧迪)；熒光定量PCR儀(7500型，ABI)；高速低溫離心機(5810R型，Eppendorf)；自制曠場實驗箱(規格100 cm×100 cm×80 cm)。

1.4 分組及模型制備

將48只SD雄性大鼠按隨機數字表法分為空白組、模型組、酸棗仁湯低、中、高劑量組及氟西汀組各8只。實驗過程中正常組大鼠不接受任何刺激，其余大鼠均單籠飼養，每天從以下7種造模方法中隨機選擇1種進行造模。造模當天(8∶00～20∶00)進行12 h斷食，正常飲水；造模當天(8∶00～20∶00)進行12 h斷水，正常飲食；造模當天(8∶00～20∶00)進行12 h鼠籠45°傾斜；向鼠籠中的墊料噴水，保持潮濕狀態12 h后更換；造模當天(19∶00至次日7∶00)持續日光燈照射12 h；將大鼠置于0 ℃冷水中，保持大鼠漂浮于水面5 min后撈出，吹風機吹干身體；將大鼠放進45 ℃烘箱內烘烤10 min，造模共持續28 d。采用行為學(糖水偏好實驗、曠場實驗)實驗進行抑郁模型評價。

1.5 給藥方法

空白組和模型組大鼠給予 0.9%氯化鈉溶液灌胃，酸棗仁湯低、中、高劑量組大鼠分別以相應劑量中藥灌胃，氟西汀組給予0.0036 g /kg氟西汀混懸液灌胃，每日1次，共28 d。

1.6 檢測指標與方法

1.6.1 糖水消耗試驗 在實驗的第0、28天分別進行糖水消耗試驗。實驗前在安靜房間內訓練大鼠適應含糖飲水，每籠同時放置2個水瓶。第1個24 h 2瓶均裝入1%蔗糖水，第2個24 h 1瓶裝1%蔗糖水、1瓶裝純水，24 h禁食禁水后開始試驗。同時給每只大鼠1瓶1%蔗糖水、1瓶純水，60 min后取出水瓶定量，并計算各組大鼠的總液體、糖水、純水消耗量及糖水偏愛(糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%)。

1.6.2 曠場實驗 曠場實驗于第28天進行，于大鼠測量體質量后檢測，其測試裝置為頂部固定有攝像頭的100 cm×100 cm×80 cm黑色敞箱，用白色油漆將底部平均分成25個等面積的正方形區域，遮蔽外界視野，降低周圍噪音。將大鼠自籠中取出稱量后置于清潔敞箱的中央空格，開始計時觀察其3 min內的自由活動。其測量方法為水平活動得分以大鼠穿越底面1格(三爪或四爪進入同一格)記1分，垂直活動得分以直立次數1次(大鼠前雙足同時離開地面)記1分，每修飾1次記1分[10]。其中水平得分反映動物的活動度，垂直得分反映動物對新異環境探究度，自我修飾得分反映動物對自身的關注度。每只大鼠監測完畢后清理大鼠排泄物，移動痕跡并消除氣味，減少其他因素對實驗的影響。

1.6.3 免疫組化法檢測DKK-1蛋白表達 曠場實驗結束后，每組取4只大鼠處死并快速取出海馬組織進行石蠟切片，脫蠟進行抗原修復、封閉，加DKK-1一抗(稀釋比為1∶100)，4 ℃冰箱保存過夜。PBS洗3次，每次5 min后加二抗，37 ℃溫箱30 min。PBS沖洗后加鏈霉親和素-生物素復合物(strept avidin-biotin complex,SABC，稀釋比為1∶100)，顯色劑顯色、復染，脫水封片，顯微鏡下觀察。用Motic3000顯微攝影系統于200倍下攝片，選用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統對陽性表達結果進行定量分析，IOD值代表蛋白相對表達量，IOD值=陽性面積×平均光密度。海馬CA3區細胞核、細胞質或細胞膜中出現棕黃色顆粒即為DKK-1陽性細胞[11]。每張切片在光鏡下隨機分析4個高倍鏡視野，取其均值代表該片的相對表達量。

1.6.4 熒光定量 PCR檢測β-catenin及GSK-3β mRNA 表達 在GenBank上查詢到β-catenin及GSK-3β基因序列，利用Primer Premier 7.0軟件設計引物(引物序列見表1)。每組取余下的4只大鼠處死并快速取出海馬，加入裂解液制備組織勻漿，按20∶1的比例加入Trizol后提取總RNA。將總RNA反轉錄成cDNA。采用20 μL反應體系，用β-actin作為內參校正，按照Thermo說明書，在96孔板中依次加入Maxima SYBR Green qPCR Master 10 μL，Forward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，cDNA 1 μL，Water 7 μL，每個樣本均設置3個副孔。反應條件：預變性94 ℃，3 min；變性，94 ℃，30 s；退火，延伸，60 ℃，30 s；共計40個循環。采用2-△△CT法計算目的基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 行為學實驗結果

2.1.1 各組大鼠體質量比較 表2示，與空白組比較，模型組大鼠體質量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，酸棗仁湯中、高劑量組及氟西汀組大鼠體質量均明顯增長，差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。

表2 各組大鼠行為學實驗結果比較

2.1.2 各組大鼠糖水消耗實驗結果比較 表2示，與正常組比較，模型組大鼠的總液體消耗量、糖水消耗量及糖水偏愛百分比均明顯下降(P<0.01)。與模型組比較，酸棗仁湯中劑量組糖水偏愛百分比明顯增加(P<0.01)；酸棗仁湯高劑量組與氟西汀組總液體消耗、糖水消耗及糖水偏愛百分比均明顯增加(P<0.05,P<0.01)。

2.1.3 各組大鼠曠場實驗結果比較 表2示，與空白組比較，模型組大鼠的水平得分、垂直得分和修飾得分均明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，酸棗仁湯各劑量組及氟西汀組水平得分均明顯增加(P<0.05,P<0.01)；酸棗仁湯高劑量組及氟西汀組垂直得分均明顯增加(P<0.01,P<0.05)。

2.2 免疫組化染色結果

圖1表3示，空白組大鼠海馬CA3區中DKK-1蛋白陽性表達較少且呈淺棕黃色。與空白組比較，模型組大鼠海馬CA3區中DKK-1蛋白陽性表達明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，酸棗仁湯各劑量組及氟西汀組大鼠海馬CA3區中DKK-1蛋白陽性表達均明顯降低(P<0.01)。

圖1 各組大鼠海馬CA3區DKK-1蛋白表達變化(免疫組化染色，標尺50 μm)

表3 各組大鼠海馬CA3區中DKK-1蛋白IOD值比較

2.3 熒光定量PCR法檢測海馬β-catenin及GSK-3β mRNA表達結果

表4示，與空白組比較，模型組大鼠海馬GSK-3β mRNA相對表達量明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，酸棗仁湯高劑量組大鼠海馬β-catenin、GSK-3β mRNA相對表達量均明顯升高(P<0.05)。

表4 各組大鼠海馬組織β-catenin和GSK-3β比較

3 討論

結構影像學和病理解剖學研究發現，抑郁癥患者會出現海馬體積萎縮等現象[12]。Wnt信號通路參與諸多細胞復雜的生化反應，進而調節中樞神經系統，與多種神經精神疾病的發生密切相關。DKK-1、β-catenin及GSK-3β是該通路的3個重要調節因子，可調控細胞增殖、分化以及遷移[13，14]。研究表明，DKK-1表達異常可影響特定通路、環路及相關信號蛋白與基因，臨床可出現異常神經發育、障礙性認知和異常情緒等神經精神疾病。DKK-1可阻斷Wnt信號在胞內的傳遞，若下調海馬中DKK-1水平，可修復神經細胞并減少細胞凋亡，發揮抗抑郁作用[15]。本研究結果顯示，酸棗仁湯可顯著降低海馬CA3區DKK-1蛋白表達水平，改善抑郁癥狀。

DKK-1可抑制細胞內GSK-3β活性和下游β-catenin降解，通過降低β-catenin與GSK-3β表達，抑制細胞增殖，從而影響海馬神經元的調控。β-catenin與GSK-3β在腦組織尤其是海馬呈高表達，并參與神經發生、突觸可塑性及穩態形成[8]，海馬腦區的β-catenin含量增加與快速產生抗抑郁效應呈正相關[16]。實驗結果顯示，酸棗仁湯高劑量提高了大鼠海馬組織β-catenin基因表達水平，可能通過影響海馬結構及功能發揮抗抑郁作用。

若GSK-3β磷酸化水平降低，Wnt信號通路功能紊亂，最終可影響神經元可塑性或導致其凋亡[17]。動物出現抑郁行為，酪氨酸磷酸化GSK-3β的增加與β-catenin水平的顯著降低呈負相關[18]，通過上調GSK-3β基因表達水平，可顯著改善抑郁癥狀[19]。實驗顯示，高劑量酸棗仁湯可提高大鼠海馬組織β-catenin與GSK-3β基因表達水平，與上述研究結論一致。

酸棗仁湯在選藥上動靜相配，酸棗仁養肝血、安心神為君藥；川芎調血養肝，茯苓寧心安神為臣藥；知母滋陰降火、清熱除煩為佐藥；甘草和中緩肝為使藥，治法上通補并用，有養血調肝、寧心安神、解熱除煩之效。中藥藥理學研究已證實，酸棗仁皂甙、知母總皂苷、茯苓多糖、甘草苷均具有抗抑郁和神經元保護作用[20-22]。本研究通過觀察酸棗仁湯干預CUMS模型大鼠海馬中上述指標變化，顯示出酸棗仁湯具有較好的抗抑郁作用，其作用機制可能與其對海馬神經元的保護作用有關。