肉制品中總磷含量測定及國際標準制定研究

褚佳玥　葛淑麗　馬躍龍

摘要：本研究采用電感耦合等離子體發射光譜儀（ICP-OES）測定肉與肉制品中的總磷元素。以磷元素特征譜線波長定性，在一定濃度范圍內，磷元素的譜線信號強度與其濃度成正比，采用標準曲線法進行定量。再通過對標準物質和一系列有代表性的肉制品樣品的系統性實驗分析，驗證了該方法的適用性、準確度和精密度。通過組織國內外14家分析實驗室進行的國際實驗室間比對，依據ISO 5725-2：2019《測量方法與結果的準確度（正確度與精密度） 第2部分：確定標準測量方法重復性與再現性的基本方法》，使用科克倫（Cochran） 檢驗以格拉布斯（Grubbs）檢驗對收集到的數據進行了離群值篩選，并計算得到目標離子測定的重復性與再現性標準差，最終擬合得到精密度值和平均水平之間的函數關系，統計結果表明該方法適用性廣且精密度高，因而被推薦為新的ISO國際標準。

關鍵詞：總磷 肉制品 國際標準 ICP-OES

Determination of Total Phosphorous Content in Meat Products and the Development of International Standard

Chu Jiayue， Ge Shuli， Ma Yuelong

（Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research）

Abstract： This research is to determine the total phosphorous content in meat products by Inductively coupled plasma optical emission spectrometry（ICP-OES） method. Based on the characteristic spectral line wavelength of phosphorus， within a certain concentration range， the spectral line signal intensity of phosphorus is directly proportional to its concentration， and the standard curve is used for quantification. The applicability， accuracy and precision of the method is verified by systematic experimental analysis on both reference materials and a series of representative meat products. An international ring comparison test with 14 participating labs around the world was conducted. According to ISO 5725-2：2019 Accuracy of measurement methods and results （trueness and precision）—Part 2： Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method， using Cochran （Cochran） test with Grubbs test on the collected data for the selection of outliers， and calculate the target ion determination repeatability and reproducibility of the standard deviation， the end fitting precision value and the function relationship between the average level. Statistical analysis revealed that the new method is both universal and precise， thus it is recommended as new ISO standard.

Key words： total phosphorous content， meat products， international standard， ICP-OES

0 引言

人們日常飲食中磷的攝入量70%～80%來自食物本身的磷[1-2]，20%～30%來自于含磷的磷酸鹽的食品添加劑[3-5]。磷酸鹽作為世界范圍內肉制品產業無可替代的食品添加劑[6]，在肉制品加工中，添加磷酸鹽能用于控制肉制品的顏色、微生物等[7-8]，同時可以增強肌肉蛋白質在鹽水體系中的溶解性，提高持水性 [9-10]。但是過量地攝入，會危害身體健康。多年來對磷酸鹽進行了數次安全性評估，歐盟食品安全局（EFSA）最新規定它的每日容許攝入量（ADI）≤40 mg/kg[11]。世界各國在肉與肉制品標準中磷酸鹽的使用限量均有嚴格規定。CAC最大使用量2200 mg/kg[11]，腌制肉制品天然含有和添加的磷酸鹽8000 mg/kg，肉湯等磷酸鹽總量1000 mg/kg（以P2O2 計）[11]。歐盟最大使用量5 g/kg與我國GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中對肉制品中磷酸鹽限量值一樣[4-5]。

目前肉及肉制品總磷定量測定方法主要分為重量法、分光法和電感耦合等離子體發射光譜法（ICP-OES）等方法[12-13]。歐美等國家目前都有各自的檢測標準，例如，ISO 13730：1996《肉及肉制品總磷含量的測定 分光法》和ISO 2294：1972《肉及肉制品 總磷含量的測定 重量法》;歐盟標準BS EN 16943：2017和FDA EAM以及ISO 27085：2009都是用ICP-OES方法檢測多種元素其中就包括了磷。考慮到當前世界各國檢測磷元素的方法多已發展為電感耦合等離子體發射光譜法（ICP-OES），現有國際標準ISO 2294：1994和ISO 13730：1996無法滿足世界各國對于食品中總磷含量的檢測趨勢，本項目的研究將在原有標準重量法和分光法的基礎上，增加世界主流國家均采用的ICP-OES方法，檢出限降低至1.0 mg/kg，并擴大標準的適用范圍至多種可食部位。從而建立起一套檢出限低、定性定量準確、使用范圍廣泛的國際標準檢測方法。

現有重量法檢測總磷的方法耗時長，檢測靈敏度低;分光法步驟煩瑣，前處理濕法消解試驗危險性大[12，14]。本試驗以GB 5009.268—2016《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》為基礎，綜合考慮世界各國總磷含量的檢測方法[12-14]，選用微波消解為前處理方法，用ICP-OES法檢測肉與肉制品中總磷含量，并向國際標準化組織“肉、禽、魚、蛋及其制品標準技術委員會”提出建立新的總磷國際標準的工作提案，項目申請獲得了投票批準。新的檢測方法大大縮短檢測時間，降低方法檢出限，適用于鮮肉和熟肉及其制品、動物內臟、腸等各種肉類。并且該方法通過對標準物質和一系列有代表性的肉類樣品系統性實驗分析[15-16]，證實了該方法具有較寬的線性范圍、較高準確度和精密度。經技術委員會的推薦，由14家分析實驗室進行了國際實驗室間比對[17-18]，統計結果表明該方法的適用性廣且精密度高，新的國際標準已發布。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

超純水（一級）：Millipore制備;硝酸（優級純或更高純度，國藥集團化學試劑有限公司）;硝酸溶液（5+95，國藥集團化學試劑有限公司）：取50 mL硝酸，緩慢加入950 mL水中，混勻;磷元素標準儲備液（1000 mg/L，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

Avio 500電感耦合等離子體發射光譜儀（美國，珀金埃爾默PerkinElmer）;ME-T電子天平（瑞士梅特勒）：感量為0.0001 g;CEM Mars6微波消解儀（美國培安公司）：配有聚四氟乙烯消解內罐;IKA T25樣品粉碎設備：勻漿機（德國）。

1.3 實驗方法

樣品微波消解后，采用電感耦合等離子體發射光譜儀測定，以磷元素特征譜線波長定性;在一定濃度范圍內，磷元素的譜線信號強度與其濃度成正比，采用標準曲線法進行定量。每個樣品測兩次，再計算方法檢出限、線性、精密度、加標回收率等。

1.4 試樣樣品

方法開發與研制階段使用的樣品種類做到了盡可能覆蓋各種肉類，包括A牛肉、B雞肉、C鴨肉、D羊肉、E豬肉共5個樣品。5種肉類基質（豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉）的凍干粉末（上海食品研究所提供），每瓶樣品凈含量為6 g，共10瓶樣品。每種基質2瓶樣品，檢測1瓶，備樣1瓶。

1.5 試樣制備

實驗前，需等待干粉樣品恢復至室溫后，充分搖晃樣品瓶，保證樣品均勻性。稱取干粉樣品0.1g（m0），精確至0.0001 g，至消解罐中。取樣品量4倍質量的超純水m1，復溶凍干粉末，等干粉復水膨脹約10 min后（平衡樣品），按照實驗前處理要求處理樣品。（m= m0+m1）

1.6 磷元素標準系列溶液

磷元素標準系列溶液（國藥）：精確吸取適量標準貯備液，用硝酸溶液（5+95）逐級稀釋配成標準系列溶液，質量濃度分別為0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、40.0 mg/L、60.0 mg/L、80.0 mg/L。可根據儀器靈敏度及樣品中磷元素實際含量，適當調整標準系列溶液質量濃度范圍。

1.7 ICP-OES條件

水平觀測;功率：1200 W;等離子氣流量：15 L/min;輔助氣流量：0.5 L/min，霧化氣氣體流量：0.65 L/min，待測譜線：213.6 nm。

1.8 微波消解

向復溶后的樣品基質中加入5 mL～10 mL硝酸，加蓋消解罐放置1 h或過夜，旋緊罐蓋，按照微波消解儀標準操作步驟進行消解，消解參考條件為一階段110 ℃，升溫5 min，恒溫10 min，二階段150 ℃，升溫5 min，恒溫10 min，三階段195 ℃，升溫5 min，恒溫20 min。冷卻后取出，緩慢打開罐蓋排氣，用少量水沖洗內蓋，將消解罐放在控溫電熱板上于100 ℃加熱30 min，用水定容至25 mL。

1.9 測定

標準曲線繪制：將標準系列工作溶液注入電感耦合等離子體發射光譜儀中，測定分析譜線的強度信號響應值，以元素濃度為橫坐標，其譜線強度響應值為縱坐標，繪制標準曲線。 試樣測定：將空白溶液和試樣溶液分別注入電感耦合等離子體發射光譜儀中，測定分析譜線強度的信號響應值，根據標準曲線得到消解液中磷元素濃度。

1.10 結果計算

試樣中磷含量按下式計算：

其中，m = m0+ m1

式中：

X ——試樣中磷含量，單位為毫克每千克（mg/

kg）;

ρ ——試樣溶液中磷質量濃度，單位為毫克每升

（mg/L）;

ρ0——試樣空白液中磷質量濃度，單位為毫克每

升（mg/L）;

V ——試樣消化液定容體積，單位為毫升（mL）;

f? ——試樣稀釋倍數;

m ——樣品和超純水稱樣量，單位為克（g）;

m0——樣品稱樣量，單位為克（g）;

m1——超純水稱樣量，單位為克（g）。

計算結果保留三位有效數字。

2 結果與分析

2.1 檢出限

依次測定標準空白溶液，得到標準工作曲線，在相同條件下測得20次試樣空白，得到20次空白值的標準偏差SD。3倍的SD值以稱樣量和定容體積計算即為方法的檢出限，10倍的SD值以稱樣量和定容體積計算即為方法的定量限，檢出限和定量限見表1所示（以稱樣量0.5 g，定容體積25 mL計）。

2.2 標準曲線及線性范圍

用電感耦合等離子體發射光譜儀測定標準系列工作溶液的吸光度，以元素的響應值為縱坐標，元素的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，所得的線性回歸方程及相關系數見表2，磷元素標準溶液濃度在0 mg/L～100 mg/L，范圍內線性良好，相關系數R>0.999。

2.3 精密度

以豬肉作為基質，在相同檢測條件下，對樣品進行測定，重復6次，所得數據重復性結果見表3，RSD為0.75%<2%，符合美國公職分析化學家協會（AOAC）制定的關于方法精密度驗證的相關要求[19]，即精密度良好。

2.4 準確度

以豬肉作為基質，在待測樣品中加入一定已知濃度的標準溶液，按與基質相同的前處理方法和檢測方法進行測定[15-16]，加標分為三個梯度水平，每個加標水平重復做三次，結合方法的檢測限及肉品中的普遍含量，回收數據見表4。樣品中不同濃度的加標回收率在95.8%～107.7%，符合美國公職分析化學家協會（AOAC）制定的關于方法準確度驗證的相關要求[19]，即回收率要求在85%～110%，表明該方法的準確度良好。

2.5 國際實驗室間比對研究

通過上述研究可以確定，新的肉制品中ICP-OES檢測方法能得到有效精確的檢測結果。經技術委員會的推薦，由14家分析實驗室進行了國際實驗室間比對，考察新方法的普適性和精密度（重復性和再現性），進而確認方法的有效性。試驗樣品包括A牛肉、B雞肉、C鴨肉、D羊肉、E豬肉共5個樣品[15-16，20]，每個樣品做雙平行實驗。

在國際標準的制定過程中，為了確定檢測方法的再現性，組織開展了國際實驗室間比對，收集了14家實驗室對5種肉類制品分別進行測定，數據見表5。依據ISO 5725-2：2019《測量方法與結果的準確度（正確度與精密度） 第2部分：確定標準測量方法重復性與再現性的基本方法》，使用科克倫（Cochran） 檢驗以格拉布斯（Grubbs）檢驗對收集到的數據進行了離群值篩選，并計算得到目標離子測定的重復性與再現性標準差[17-18]，最終擬合得到精密度值和平均水平之間的函數關系。

2.5.1 數據一致性和離群性檢驗

根據ISO 5725-2：2019，在對采用實驗室間比對所得的檢測數據進行平均值和精密度參數計算前，必須對數據的有效性（一致性）進行統計檢驗，剔除對結果可能造成干擾的離群值。

（1）Mandel檢驗

本研究首先采用Mandel的實驗室間一致性統計量h和實驗室內一致性統計量k來檢驗上述原始數據的一致性，即對每個實驗室i的每個水平j計算實驗室間的一致性統計量h和每個實驗室內的一致性統計量k，以每個實驗室的不同水平為一組（組內數據按縮二脲質量分數水平次序排列）進行描點作圖，結果如圖1和圖2所示，圖中水平虛線分別表示顯著性水平為1% 及5% 時的Mandel 統計量h 與k的臨界值。

圖1可以看出，實驗室6在樣品水平C，實驗室4在樣品水平E上出現了歧離值。

圖2可看出：實驗室4在樣品水平A和實驗室5在樣品水平D上出現了離群值（即重復性測試結果有較大的變異）。實驗室7在樣品水平C，實驗室12在樣品水平E上出現了歧離值。

Mandel統計圖提示需要采用數值離群Cochran和Grubbs檢驗法對數據做進一步分析。

（2）Cochran檢驗

實驗室間比對數據有效性的一項重要假設是各參與實驗室所提交數據的實驗室內方差沒有顯著差異[19]。按 ISO 5725-2：1994的要求，首先采用針對實驗室內一致性的 Cochran 檢驗法對各實驗室的數據進行分析，如果計算所得Cochran 統計量C大于置信水平 5% 臨界值但小于等于置信水平1%臨界值，則對應被檢驗項目為歧離值;若計算所得 Cochran 統計量C大于置信水平 1% 臨界值，則對應被檢驗項目為離群值見表6。

表6顯示，在水平A，Cochran統計量C的計算結果為0.627，超過了其離群值臨界值0.599;在水平D，Cochran統計量C的計算結果為0.560，接近臨界值上限0.599。表明針對這2個水平的樣品測試中，有實驗室數據不能使用，基本與圖2的直觀結果符合。經過進一步分析，實驗室4在水平A和實驗室5在水平D所測數據的絕對差值最大，應當拒絕這2個結果。

舍棄2個數據后，對其余13家實驗室在水平A和D的測試值分別再次進行Cochran檢驗。如表7所示，不存在離群值和歧離值。

（3）Grubbs檢驗

Grubbs 檢驗是針對實驗室間數據一致性進行的數理檢驗[15-16]，此處檢驗是針對通過 Cochran 檢驗后保留的數據，其在水平A和水平D剩余13個數據，計算得到的Grubbs檢驗結果見表8。

對于單側離群值的Grubbs檢驗，如果計算所得Grubbs檢驗統計量G大于置信水平5%臨界值，但小于或等于置信水平1%臨界值，則對應被檢驗項目為歧離值。如檢驗統計量G大于置信水平1%臨界值，則對應被檢驗項目為離群值。

對于雙側離群值的Grubbs檢驗，如果計算所得Grubbs檢驗統計量G小于置信水平5%臨界值為歧離值。如檢驗統計量G小于置信水平1%臨界值為離群值。

表8表明，14家實驗室的現存所有數據（經Cochran統計檢驗保留的有效數據）中不存在離群值和歧離值，均為通過數理統計檢驗的有效數據。

2.5.2 平均值和標準偏差的計算分析

通過上述數據一致性和離群值的統計檢驗，將14家實驗室采用ICP-OES法測定肉與肉制品中總磷質量分數的平均值（m），重復性標準差（sr）和再現性標準差（sR）進行了計算。

考察表9中標準差與m的關系，發現標準差與m沒有明顯的線性關系，但是有對數關系;sr，sR，lgsr，lgsR與平均值m的關系，發現lgsr和lgsR與m存在較強的正相關系。數據擬合結果證實了這一猜測，兩者存在如下線性關系：

lgsr=0.9574lgm-1.8295? ?R2=0.8787

lgsR=0.698 lgm-0.1868? ?R2=0.7252

重復性限lgsr=2.6807lgm-5.1226

再現性限lgsR=1.9544 lgm-0.5230

3 結論與討論

通過國際實驗室間比對活動，不僅考察了肉制品研究開發的ICP-OES的普適性及精密度，還在試驗過程中得到了參與實驗室的反饋意見，對該方法進一步規范化具有積極意義。

一部分參與實驗室，如實驗室4和5在前處理過程中，沒有把硝酸趕盡，會導致最終的ICP檢測結果偏高。這也是在標準中規定緩慢打開罐蓋排氣，將消解罐放在控溫電熱板上于100℃加熱30min的原因。

為確定試驗方法的精密度，對肉與肉制品中總磷含量開展國際實驗室間比對試驗，在試驗方案實施過程中共收集到14個實驗室并提供了試驗結果。本標準以國家標準為基礎，優化和統一了前處理肉制品的步驟，統一用微波消化，收到的國內外14家實驗室的數據都在誤差范圍內，說明該實驗方案有高度的統一性。

對于最后的實驗數據統計，我們按照ISO的統計原理和要求，對試驗結果的精密度按ISO 5725-2：1994 進行統計，共發現有 2個離群值，沒有離群實驗室，所產生的離群值是由隨機誤差引起的。精密度結果表明研究開發的ICP-OES測定肉與肉制品中總磷含量是可行的，各實驗室間的測定值有較好的一致性，經統計得到的精密度結果能用來確定試驗方法的重復性標準差和再現性標準差。此方法有較寬的線性范圍、較高的準確度和精密度，通過組織國內外 14個分析實驗室進行國際實驗室間比對，統計結果表明該新方法適用性廣且精密度高，因而被推薦作為新的國際標準。

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