桃紅四物湯對糖尿病腦病大鼠認知功能的保護作用

章夢玲，蔡 明，4，夏文文，戴文濤，趙夢蝶，韓燕全，韓 嵐，彭代銀

(1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230012；2.新安醫學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230012；3.中藥復方重點實驗室，安徽 合肥 230012；4.安徽中醫藥大學第二附屬醫院，安徽 合肥 230061；5.六安市中醫院，安徽 六安 237000；6.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031)

糖尿病是一種由于胰島素分泌不足，或周圍組織產生胰島素抵抗而引起的代謝紊亂的疾病，其特征之一在于血液中的高水平葡萄糖[1-2]。而體內長期持續性高血糖會造成人體的多種組織器官損害，包括足部、腎臟、骨骼等[3-5]。同時，長期暴露在高糖環境中會引起腦部氧化應激的產生，造成腦部神經細胞的死亡，從而對患者的認知功能造成影響，形成糖尿病腦病(diabetic encephalopathy，DE)[6]。糖尿病患者體內的胰島素抵抗會導致β-淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)的聚集，加重神經毒性損傷大腦[7]。Aβ還可以通過增加氧化應激誘導神經細胞死亡，而氧化應激也會增加Aβ的產生，造成更多的氧化損傷，促進相關的神經細胞凋亡[8]。桃紅四物湯來源于中醫的傳統名方，其中包含的成分可以透過血腦屏障在腦內發揮作用，減少神經細胞的凋亡[9]。值得注意的是，通過網絡藥理學的技術對桃紅四物湯治療疾病的KEGG富集分析發現，桃紅四物湯對糖尿病相關通路有很好的調節作用[14]。這表明桃紅四物湯、DE、Aβ和氧化應激之間有著潛在關聯。本研究在前期研究基礎上復制DE模型，觀察桃紅四物湯對DE的干預和治療作用，及其對Aβ沉積和氧化應激的影響，進一步探討桃紅四物湯治療DE的可能機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級7周齡雄性SD大鼠90只，體質量為240～260 g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[生產許可證號：SCXK(魯)2019-0003]提供，所有動物實驗過程均經安徽中醫藥大學動物管理與使用委員會批準，動物倫理編號：AHUCM-rats-2021056。大鼠飼養于20～26 ℃環境下，相對濕度為40%～70%，12 h/12 h晝夜交替，給予自由飲水和標準飼料，適應性飼養1周。

1.2 藥物 桃紅四物湯的制備：熟地黃、當歸、白芍、川芎、桃仁、紅花的質量比為4∶3∶3∶2∶3∶2，按比例稱取6味藥材后，加入藥物總質量的10倍量的蒸餾水冷凝回流提取2 h，過濾并且保留濾液，濾渣加入藥物開始總質量的8倍量的蒸餾水冷凝回流提取2 h后再過濾，將兩次濾液合并，并且旋轉蒸發濃縮成18 g/kg的濃縮液， -20 ℃保存備用。

1.3 試藥 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，批號 EZ34148220，純度> 98%)：德國Biofrxx；高糖高脂飼料(10%豬油、10%蔗糖、2.5%膽固醇、77.5%基礎飼料)；二甲雙胍(批號 ABS5837)：中美上海施貴寶；多奈哌齊(批號 2010014)：中國衛材；試劑盒三酰甘油(triglycerides，TG；批號 202007311)、總膽固醇(total cholesterol，TC；批號 202006511)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C；批號 202006211)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C；批號 202011271)：上海振科；淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP；批號 ab241592)、β-分泌酶(β-secretase，BACE；批號 ab183612)：英國Abcam；β-淀粉樣蛋白1-40(amyloid-β 1-40,Aβ1-40；批號 D8Q7I)、Aβ1-42(批號 D9A3A)：美國Cell Signaling Technology；GAPDH(批號 R24404)：正寧生物；兔抗(批號 A21030)、鼠抗(批號 A25022)：美國Abbkine；過氧化脂質(lipid peroxide，LPO；批號 20210708)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS；批號 20210711)：南京建成；引物序列：Aβ1-40(上游引物：5′-TCGTGATTCCTTACCGGTGC-3′；下游引物：5′-TCGTGATTCCTTACCGGTGC-3′)，Aβ1-42(上游引物：5′-TGTGCTCGTCTTGCTCCTGACTA-3′；下游引物：5′-CTCAGCAGAGGCATCCATGTTC-3′)，BACE1(上游引物：5′-TTTCCCAGTCATTTCACTTTACCT-3′；下游引物：5′-ACTCATCTGTCTGTGGAATGTTGT-3′)，APP(上游引物：5′-CCCATCAGGGACCAAAACC-3′；下游引物：5′-GAAGGGCATCGCTTACAAACT-3′)。

1.4 儀器 自動脫水機(ZT-12M)、石蠟包埋機(YB-7B)：孝感亞光醫用電子技術有限公司；包埋機(JB-P5)：武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(RM2016)：上海徠卡儀器有限公司；組織切片機(KD-P)：金華市科迪儀器設備有限公司；烤箱(DGX-9003B)：上海福瑪實驗儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡(Nikon Eclipse TI-SR)、成像系統(Nikon DS-U3)：日本尼康；轉膜儀(VE-186型)、電泳儀(EPS 300 型)、電泳槽(VE-180 型)：上海天能科技有限公司；超靈敏多功能成像儀(AMERSHAM IMAGER 600)：美國GE；全波長酶標儀：美國Thermofisher；熒光定量PCR儀(MX3000P)：美國Agilent。

2 方法

2.1 DE模型的建立 大鼠適應性飼養1周，隨機分出10只作為對照組，給予普通基礎飼料喂養；其余大鼠給予高糖高脂飼料喂養4周，并且記錄體質量和血糖值，4周后采用STZ(35 mg/kg)一次性腹腔注射。3 d后對所有大鼠尾靜脈采血測量隨機血糖，如果血糖值高于16.7 mmol/L，則判定糖尿病大鼠模型建立成功。對成功建立糖尿病模型的大鼠繼續監測5周的體質量和血糖情況，并且采用Morris水迷宮觀察大鼠學習記憶能力，判定DE模型是否建立成功。

2.2 分組及治療 選取成功建立DE模型的大鼠，隨機分為模型組(蒸餾水)、桃紅四物湯低劑量組(4.5 g/kg，相當于臨床等效劑量1倍)、桃紅四物湯中劑量組(9 g/kg)、桃紅四物湯高劑量組(18 g/kg)、二甲雙胍組(0.2 g/kg)、多奈哌齊組(1 mg/kg)，每組10只，每天灌胃給藥1次；另取正常雄性大鼠10只作為對照組。期間所有大鼠均自由飲水與攝食，連續5周。

2.3 Morris水迷宮實驗 連續4 d進行訓練，分別從4個象限入水，引導大鼠學會尋找平臺。第5天固定一個入水點，記錄大鼠從入水到爬上平臺花費的時間，即潛逃潛伏期。如果90 s內找不到平臺，潛逃潛伏期記為90 s，并記錄大鼠逃避路徑。

2.4 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色觀察大鼠海馬組織神經細胞形態變化 取固定于4%多聚甲醛中的大鼠海馬組織，每組3個樣品組織放入脫水盒中編號，并用不同濃度的乙醇進行脫水處理，再用二甲苯進行透明以及浸蠟處理。再對組織進行包埋、切片和烘干。將烘干的組織切片脫蠟后采用不同濃度的乙醇水洗，采用HE進行染色和脫水，最后用中性樹膠進行封片，晾干并觀察。

2.5 大鼠腦組織勻漿和血清的生化分析 取大鼠腦組織勻漿進行生化分析，LPO含量和NOS活性采用LPO含量檢測試劑盒(比色法)和NOS測定試劑盒(比色法)進行測定。取大鼠腹主動脈血清對血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C進行測定，所有步驟按照試劑盒說明書操作。

2.6 實時定量聚合酶鏈反應法檢測大鼠腦組織APP、BACE1、Aβ1-40、Aβ1-42mRNA表達水平 每組稱取3只大鼠海馬組織50～100 mg，液氮研磨后，采用TRIzol法提取組織總RNA。采用cDNA 試劑盒，進行反轉錄得到cDNA。最后取cDNA作為熒光定量的模板，進行熒光定量PCR反應，實驗重復3次。以β-actin 作為內參，采用2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達水平。

3 結果

3.1 桃紅四物湯對DE模型大鼠血糖與體質量的影響 在適應性飼養1周結束后，各組大鼠體質量持續增加，隨機血糖值均小于6 mmol/L；模型復制2周后，模型組大鼠體質量開始持續減低，隨機血糖大于16.7 mmol/L；與模型組比較，各給藥組大鼠體質量差異無統計學意義(P>0.05)，桃紅四物湯高劑量組及二甲雙胍組大鼠血糖值明顯下降(P<0.05)。見圖1。

3.2 桃紅四物湯對DE模型大鼠學習記憶能力的影響 對照組大鼠水迷宮逃避潛伏期時間較短；與對照組比較，模型組逃避潛伏期時間明顯延長(P<0.05)；與模型組比較，桃紅四物湯高、中劑量給藥組和二甲雙胍、多奈哌齊組大鼠的逃避潛伏期明顯降低(P<0.05)。見圖2。

注：A.正常組；B.模型組；C.桃紅四物湯低劑量組；D.桃紅四物湯中劑量組；E.桃紅四物湯高劑量組；F.二甲雙胍組；G.多奈哌齊組；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 桃紅四物湯對DE模型大鼠血脂水平的影響 與對照組大鼠比較，模型組大鼠LDL-C、TG、TC的含量均顯著升高(P<0.05)，HDL-C含量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，桃紅四物湯給藥組與二甲雙胍、多奈哌齊組LDL-C、TG、TC含量均顯著下降(P<0.05)，HDL-C水平顯著升高(P<0.05)。結果表明桃紅四物湯對大鼠血脂水平具有一定的調控作用。見圖3。

3.4 桃紅四物湯對DE模型大鼠神經細胞的保護作用 對照組大鼠海馬組織神經細胞排列整齊，密度較大，分布均勻，細胞輪廓清晰，同時細胞核圓潤且明顯。與對照組比較，模型組海馬組織神經細胞數量顯著減少，排列結構紊亂，細胞輪廓不清晰，形態異常。桃紅四物湯的干預改善了這一情況，明顯增加了正常神經細胞的數量，神經細胞的形態較正常，部分神經細胞的細胞核圓潤且明顯，結構較完整，排列相對有序。見圖4。

3.5 桃紅四物湯對DE模型大鼠氧化應激水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠腦組織LPO含量、NOS活力均顯著增加(P<0.05)。與模型組比較，桃紅四物湯各給藥組大鼠LPO含量、NOS活力均顯著降低(P<0.05)。結果表明，桃紅四物湯能夠明顯改善DE模型大鼠體內氧化應激水平，從而對神經細胞發揮一定的保護作用。見圖5。

注：A.正常組；B.模型組；C.桃紅四物湯低劑量組；D.桃紅四物湯中劑量組；E.桃紅四物湯高劑量組；F.二甲雙胍組；G.多奈哌齊組；藍色點為起點，紅色點為終點；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

注：A.正常組；B.模型組；C.桃紅四物湯低劑量組；D.桃紅四物湯中劑量組；E.桃紅四物湯高劑量組；F.二甲雙胍組；G.多奈哌齊組；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

注：A.正常組；B.模型組；C.桃紅四物湯低劑量組；D.桃紅四物湯中劑量組；E.桃紅四物湯高劑量組；F.二甲雙胍組；G.多奈哌齊組

注：A.正常組；B.模型組；C.桃紅四物湯低劑量組；D.桃紅四物湯中劑量組；E.桃紅四物湯高劑量組；F.二甲雙胍組；G.多奈哌齊組；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.6 桃紅四物湯對DE模型大鼠海馬組織中Aβ沉積的作用 與對照組比較，模型組大鼠海馬組織中APP、BACE1、Aβ1-40、Aβ1-42mRNA表達水平顯著上調(P<0.05)；與模型組比較，桃紅四物湯各劑量組APP、BACE1、Aβ1-40、Aβ1-42mRNA表達水平顯著下降(P<0.05)。見圖6。

注：A.正常組；B.模型組；C.桃紅四物湯低劑量組；D.桃紅四物湯中劑量組；E.桃紅四物湯高劑量組；F.二甲雙胍組；G.多奈哌齊組；注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

越來越多的證據表明，2型糖尿病患病率的急劇增加與肥胖、血脂等多種因素密切相關[11]。有研究[12]表明，長時間的高血糖狀態會對大鼠的認知功能會造成損傷，發展為DE。

中醫認為糖尿病的病機為氣虛寒凝血瘀[13-14]，氣虛則帥血無力，血液行緩；加之糖尿病患者喜食肥甘，糖脂積滯成濁，多挾痰濁。DE多屬于本虛標實，其中氣陰兩虛為本、痰濁瘀阻為實[15]。現代西醫常用二甲雙胍治療2型糖尿病，多奈哌齊抑制中樞乙酰膽堿酯酶治療認知功能障礙，然而二者的治療效果單一。因此，越來越多的學者對中醫藥治療DE的效果展開研究[16]。桃紅四物湯來源于《醫宗金鑒》，現代藥理學研究[17]發現，桃紅四物湯通過調節神經營養因子的表達，對腦部神經細胞發揮保護作用。本實驗研究結果表明，桃紅四物湯能夠顯著改善DE模型大鼠的血糖和血脂水平。桃紅四物湯可以降低DE模型大鼠的氧化應激反應，抑制APP和BACE1的表達，從而抑制Aβ的產生，發揮神經細胞的保護作用，改善DE模型大鼠的學習記憶能力。

DE模型大鼠往往伴有體內血脂水平的異常，血管的功能障礙與神經退行性病變的發展具有一定的協同作用，可以加重認知功能障礙[18]。此外，Aβ的沉積能夠對大腦認知功能造成傷害，Aβ本身具有多種長度，其中Aβ1-40和Aβ1-42被認為是造成認知損害的關鍵物質[19]。Aβ是由APP水解在細胞內和內質網中產生，主要是由BACE1和γ-分泌酶切割而形成。γ-分泌酶的精確氨基酸切割位點對于阿爾茨海默病的發病機制至關重要，因為其決定了Aβ形式多肽產物的長度[20]。然而，BACE1是整個過程中的限速酶，其抑制APP和BACE1的表達從而抑制Aβ產生，這是治療阿爾茨默病的關鍵靶點[21]。本實驗研究發現，桃紅四物湯能夠抑制Aβ、APP和BACE1的表達，提示桃紅四物湯可以通過抑制APP的水解反應，從而降低Aβ的表達水平，發揮神經保護作用。同時在本實驗中，通過比較二甲雙胍和多奈哌齊兩種陽性藥與桃紅四物湯對DE的治療效果，發現二甲雙胍可以顯著降低DE模型大鼠的血糖水平，然而水迷宮實驗結果表明其對改善大鼠學習記憶能力效果不顯著。多奈哌齊可以改善學習記憶能力卻不能降低血糖。二者在改善DE模型大鼠血脂水平尤其是TG水平方面均無明顯療效。而桃紅四物湯在降低血糖的同時，能夠改善DE模型大鼠學習記憶能力、體內血脂以及氧化應激水平。

綜上所述，本研究結果表明，桃紅四物湯可能通過降低DE模型大鼠的血脂和氧化應激水平， 抑制Aβ生成的靶點APP和BACE1的表達，減少Aβ的沉積，保護神經細胞從而提高DE模型大鼠的學習記憶能力。