超高效液相色譜與單四極桿質譜法同時測定胃復春片中7個成分含量

崔雨晴，米卓爾，劉傲雪，周丹丹，沙禕煒

[鑒甄檢測技術(上海)有限公司，上海 200131]

胃復春片是由紅參、香茶菜、麩炒枳殼3味藥制成的復方制劑，是國家中藥保護品種，臨床用于慢性萎縮性胃炎、胃癌前病變、慢性淺表性胃炎、胃及十二指腸潰瘍等，具有療效好、安全性高等特點。研究[1-4]表明，人參皂苷及其代謝產物具有顯著的抗腫瘤作用，尤其是人參經蒸制成紅參后，轉化的新成分能夠加強抗腫瘤效果；香茶菜中二萜類、酚酸類、黃酮類成分，具有抑菌消炎、抗腫瘤、免疫調節等作用；枳殼中黃酮類成分，具有抗腫瘤、抗微生物、抗炎等作用。上述化學成分構成胃復春片的復雜體系，共同發揮健脾益氣、活血解毒之功效。2020年版《中華人民共和國藥典》以紅參對照藥材、人參皂苷Rb1、Re、Rg1對照品作為參照，對制劑中紅參進行薄層鑒別。含量測定項僅對麩炒枳殼中柚皮苷進行含量測定。現行標準對制劑中的香茶菜未作任何質量控制，故無法有效控制胃復春片的質量。本研究采用超高效液相色譜(ultra high performance liquid chromatography，UPLC)串聯單四極桿質譜(quadrupole dalton，QDA)法測定胃復春片中橙皮苷，新橙皮苷，迷迭香酸，人參皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1成分的含量，以期為胃復春片質量標準的提升提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters Acquity H-Class-QDA超高效液相色譜-質譜聯用儀：沃特世科技有限公司；XSE105DU電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；MS204TS/02電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；P120H超聲儀：德國Elma Schmidbauer GmbH；Elix Advantage 15超純水制備儀：默克密理博。

1.2 試藥 新橙皮苷(純度97.8%，批號 8177)：購自上海詩丹德生物技術有限公司；橙皮苷(純度95.3%，批號 110721-202019)、迷迭香酸(純度90.5%，批號 111871-201706)、人參皂苷Re(純度93.9%，批號 110754-202028)、人參皂苷Rg1(純度93.4%，批號 110703-201933)、人參皂苷Rf(純度99.3%，批號 111719-201806)、人參皂苷Rb1(純度93.1%，批號 110704-202028)：購自中國食品藥品檢定研究院。色譜純乙腈：默克公司；色譜純甲醇：默克公司；質譜純甲酸：賽默飛世爾科技有限公司；分析純甲醇：上海泰坦科技有限公司。14批胃復春片、缺紅參陰性制劑、缺麩炒枳殼陰性制劑和缺香茶菜陰性制劑均由杭州胡慶余堂藥業有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1對照品適量，加甲醇制成每毫升含橙皮苷6 μg、新橙皮苷80 μg、迷迭香酸8 μg、人參皂苷Re 8 μg、人參皂苷Rg16 μg、人參皂苷Rf 3 μg、人參皂苷Rb115 μg的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取本品研細，精密稱定0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(功率330 W，頻率37 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。同法制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：Waters X-select HSS T3(3.0 mm×150 mm，2.5 μm)；流速：0.5 mL/min；流動相：乙腈(A)-0.05%甲酸水溶液(B)。梯度洗脫程序如下：0～4 min，25%～26% A；4～5 min，26%～34% A；5～8 min，34%～35% A；8～10 min，35%～50% A；10～12 min，50%～95% A；12～13 min，95%～25% A；13～16 min，25% A。柱溫：30 ℃；進樣量：1 μL；采用電噴霧離子源(ESI源)，負離子檢測，選擇性離子監測模式(SIR)，毛細管電壓為0.8 kV，離子源溫度為600 ℃，以m/z609.13(橙皮苷、新橙皮苷，錐孔電壓20 V)、m/z359.15(迷迭香酸，錐孔電壓15 V)、m/z991.47(人參皂苷Re，錐孔電壓15 V)、m/z845.49(人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf，錐孔電壓15V)、m/z1 107.60(人參皂苷Rb1，錐孔電壓40 V)為測定離子。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性 分別精密吸取空白溶液、混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各1 μL，進樣測定，記錄色譜圖。各通道內樣品色譜圖中出現與對照品色譜圖中保留時間一致的色譜峰。色譜圖見圖1。

注:1.橙皮苷;2.新橙皮苷;3.迷迭香酸;4.人參皂苷Re;5.人參皂苷Rg1;6.人參皂苷Rf;7.人參皂苷Rb1;混合對照品溶液(A、B、C、D、E)、供試品溶液(F、G、H、I、J)圖1 對照品與供試品的高效液相色譜圖

2.3.2 線性方程、檢測限和定量限 取橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、人參皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1的混合對照品溶液，用甲醇稀釋配制為7個不同濃度的混合對照品溶液，進樣分析。以對照品的峰面積(y)對相應的濃度(x)進行線性回歸，得回歸方程、相關系數和線性范圍；以各化合物的信噪比(S/N)等于3時相對應的濃度確定為最低檢測限(limit of detection，LOD)，以各化合物的信噪比(S/N)等于10時相對應的濃度確定為最低定量限(limit of quantity，LOQ)。見表1。

表1 胃復春片中7個成分的標準曲線和LOD、LQD

2.3.3 精密度 取混合對照品溶液，連續進樣6次。橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為1.0%、0.5%、2.2%、0.8%、0.8%、2.2%、2.1%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性 按“2.1.2”項下供試品溶液的制備方法，平行制備6份供試品溶液(樣品批號：19066119)，測定橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1的峰面積，計算含量。6份樣品中橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、人參皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1含量的RSD值分別為0.6%、0.5%、2.2%、1.1%、1.0%、1.2%、0.8%，表明樣品重復性良好。

2.3.5 穩定性 同一供試品溶液在室溫條件下放置0、2、4、8、12、24 h后，進樣測定。樣品中橙皮苷，新橙皮苷，迷迭香酸，人參皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1含量RSD值分別為2.1%、1.5%、1.4%、2.1%、2.5%、2.0%、3.4%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取6份已知含量的胃復春片0.25 g，精密加入一定量的混合對照品溶液，使其加入量與所取胃復春片中各指標成分量之比控制在1∶1左右。按“2.1.2”項下制備供試品溶液，進樣測定，計算橙皮苷，新橙皮苷，迷迭香酸，人參皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1平均回收率依次為89.3%、99.9%、101.2%、94.4%、91.8%、90.4%、94.2%，RSD分別為1.5%、1.3%、2.1%、3.1%、3.5%、3.1%、2.8%，表明方法準確度良好。

2.3.7 耐用性考察 采用不同流速(0.4、0.5、0.6 mL/min)；不同柱溫(28、30、32 ℃)；不同色譜柱Waters X-select HSS T3(3.0 mm×150 mm，2.5 μm)、Agilent Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×150 mm，2.7 μm)和Waters CORTECS?T3(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)測定同一批次樣品成分含量，各成分含量RSD值均小于5%，方法耐用性良好。

2.3.8 樣品含量測定 取14批胃復春片樣品，分別按“2.1.2”項下制備供試品溶液，進樣測定，計算含量，結果14批胃復春片樣品每片含橙皮苷(0.19±0.02)mg、新橙皮苷(2.78±0.16)mg、迷迭香酸(0.48±0.21)mg、人參皂苷Re (0.23±0.02)mg、人參皂苷Rg1(0.18±0.01)mg、人參皂苷Rf(0.08±0.01)mg、人參皂苷Rb1(0.47±0.06)mg。

3 討論

3.1 指標性成分的選擇 胃復春片物質基礎研究[5]表明，枳殼中主要含柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等黃酮類成分，其中柚皮苷含量最高，2020年版《中華人民共和國藥典》標準中僅測定柚皮苷的含量，為了更全面反映制劑中枳殼質量，選取橙皮苷、新橙皮苷為測定指標。紅參為生粉入藥，人參皂苷類成分具有較弱的紫外吸收，且在制劑中的含量較低，傳統的紫外檢測器的靈敏度較差。2020年版《中華人民共和國藥典》標準中僅以人參皂苷的定性鑒別難以真實反映其質量，故選取人參皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1為定量測定指標。香茶菜并未被2020年版《中華人民共和國藥典》收載，其在處方中用量最大。本研究選擇酚酸類迷迭香酸作為指標性成分對其進行質量控制。

3.2 檢測方法的選擇 中藥復方的化學成分較復雜，采用高效液相色譜分析時間較長。王桂峰等[6]建立高效液相色譜法同時測定胃復春片中的人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、柚皮苷、新橙皮苷，檢測時間為60 min。張紅霞等[7]采用高效液相色譜串聯質譜法同時測定胃復春片中的11種成分(柚皮苷、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rd、人參皂苷20(R)-Rg3、冬凌草甲素、表諾多星醇)的含量。由于高效液相色譜串聯質譜法儀器的價格高昂，維護成本高，普及程度低等特點，無法滿足中藥企業日常的樣品檢驗需求，方法的實際應用性不高。QDA檢測器是一種質譜檢測器，能夠與液相分離系統完美兼容，對紫外檢測器或二極管陣列檢測器進行有效的補充。QDA檢測器可以獲得相當于單四極桿質譜儀的質譜信息，其價格相對較低，操作簡單，維護保養方便，在藥品分析領域的應用越來越多[8-9]。

3.3 實驗條件的優化 錐孔電壓是影響QDA檢測器相應信號強弱的關鍵參數，在參數可調的范圍內，以樣品中所含各成分色譜峰的峰面積為考核指標對其進行優化。通過加酸來調節流動相的pH，促進化合物的離子化，改善峰形。本實驗考察了乙腈-0.02%甲酸、乙腈-0.05%甲酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.05%甲酸(含2 mmol/L甲酸銨)等，結果發現，乙腈-0.05%甲酸的響應值比較穩定，且峰形對稱。同時，分別考察了提取溶劑、提取時間、料液比對成分提取的影響，優選的供試品制備方法為50%甲醇為溶劑，料液比為1∶100，超聲時間30 min。

3.4 樣品的測定 采用UPLC-QDA法對14批胃復春片中的黃酮類、酚酸類、人參皂苷類成分進行測定。結果表明，不同批次間胃復春片的黃酮類和人參皂苷類成分含量相差不大，而香茶菜中迷迭香酸含量范圍為每片0.27～1.05 mg(RSD=43.7%)，表明投料用藥材質量差異較大。本研究建立的UPLC-QDA法同時測定7個指標成分含量，可全面反映復方中麩炒枳殼、香茶菜、紅參藥材的質量，能夠有效地監控產品的穩定性，為其質量提供保障。