綠萼梅抗β淀粉樣蛋白致阿爾茨海默病細胞模型活性部位的篩選及其化學成分分析

甘宜杰，張 偉,2,3，歐金梅,2，喬金為,4，金傳山

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.新安醫學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038；3.中藥研究與開發安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；4.安徽中醫藥大學第二附屬醫院，安徽 合肥 230061)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與衰老相關的神經退行性疾病，其發病機制極其復雜，在疾病后期還會導致神經細胞功能喪失和神經細胞死亡，臨床表現為記憶損傷和行為失調[1]。目前臨床上用于治療AD的藥物只能在一定程度上改善或緩解AD患者的癥狀，但是未能緩解或阻止疾病的進程[2]。依據淀粉樣蛋白級聯假說，β淀粉樣蛋白(amyloid β，Aβ)是引起AD的主要原因，其在腦內異常分泌和沉積毒害周圍的突觸和神經細胞，最終造成神經細胞損傷[3-4]。因此，抑制Aβ沉積是預防和治療AD的關鍵。

綠萼梅是薔薇科植物綠梅花ArmeniacamumeSieb. f.viridicalyx(MakinoT). Y. Chen的干燥花蕾，屬于理氣藥，性平，味微酸，歸肝、胃、肺經，具有疏肝和中、化痰散結之功效[5]。《本草綱目》中記載梅花具有“助雅致，清神思”的功效，《本草原始》記載綠萼梅能夠安神定魂。現代藥理研究發現，綠萼梅對神經系統具有保護作用[6]，提示綠萼梅對神經退行性疾病具有預防和治療作用。人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)分化程度較低，繁殖快,其細胞形態、生理及生化功能與正常神經細胞類似，軸突明顯，是研究神經系統疾病的常用模型[7]。課題組前期研究發現，綠萼梅乙酸乙酯萃取部位分離得到的化合物對皮質酮誘導的SH-SY5Y細胞有保護作用[8]。本研究對綠萼梅水提物經大孔樹脂不同洗脫部位的抗Aβ活性進行篩選，同時結合超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜(ultraperformance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS)定性分析抗Aβ活性部位的化學成分，為綠萼梅的進一步開發和利用提供依據。

1 儀器與材料

1.1 試劑 人神經母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y細胞)：美國模式培養物集存庫(ATCC)；青霉素-鏈霉素(批號 71766505)：聯科生物技術股份有限公司；噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT；批號 0123A18)：北京雷根生物技術有限公司；胰蛋白酶(批號 112818181228)：上海碧云天生物技術有限公司；胎牛血清(fetal bovine saline,FBS)：Hyclone公司；Aβ1-42(批號 J10M9E60422)：上海源葉生物有限公司。

乙醇(化學純)：上海蘇懿化學試劑有限公司；AB-8大孔樹脂(批號 C12115168)：上海麥克林生化科技有限公司；綠原酸(批號 DST200520-021，純度≥98%)、蘆丁(批號 DSTDL001701，純度≥98%)、金絲桃苷(批號 DST200628-023，純度≥98%)、異槲皮苷(批號 DSTDY000601，純度≥98%)：成都樂美天醫藥科技有限公司；乙腈(質譜級)、甲酸(質譜級)、甲醇(質譜級)：美國Fisher公司。

1.2 主要儀器 Xevo G2 QTOF質譜儀、ACQUITY Ⅰ型超高效液相系統：美國Waters公司； 3K15型低溫高速離心機：Sigma公司；TCL-16G-A型高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；Forma 3111型水套式CO2培養箱：賽默飛世爾科技有限公司；SW-CJ-2FD型超凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；TriStar LB941微孔板式多功能酶標儀：德國Berthold公司；AB-135S型十萬分之一分析天平：德國梅特勒上海有限公司；Milli-Q型超純水儀：Millipore公司。

1.3 藥材 藥材于2019年2月購買于安徽省歙縣，經安徽中醫藥大學中藥資源中心劉守金教授鑒定為薔薇科植物綠梅花ArmeniacamumeSieb. f.viridicalyx(MakinoT). Y. Chen的干燥花蕾。

2 方法

2.1 綠萼梅抗Aβ活性部位的篩選

2.1.1 樣品的提取與制備 取50 g綠萼梅藥材，按照12、8、6倍量加入蒸餾水加熱回流提取3次，每次1 h。合并濾液并濃縮至0.5 g/mL，流經AB-8大孔樹脂，依次使用水、30%乙醇、60%乙醇、90%乙醇依次洗脫，減壓回收溶劑，分別得到水部位(ST-0)、30%乙醇洗脫部位(ST-30)、60%乙醇洗脫部位(ST-60)、90%乙醇洗脫部位(ST-90)。細胞實驗前，將各洗脫部位干浸膏用超純水超聲溶液，再用培養基稀釋至所需濃度，0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃條件下保存。

2.1.2 試劑的配制 Aβ1-42溶于0.01 mol/L PBS緩沖液中，配制成1 mmol/L的母液，4 ℃保存。各綠萼梅洗脫部位分別溶于0.01 mol/L PBS緩沖液中，配制成1 mg/mL的母液，0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃條件下保存。

2.1.3 細胞培養及分組 SH-SY5Y細胞采用含有10% FBS、青霉素(終濃度為100 μg/mL)、鏈霉素(終濃度為100 μg/mL)的DMEM/F12培養基，置于5% CO2、37 ℃條件下培養，隔天換液。選取對數生長期細胞，以每孔5×103接種于96孔培養板中。將細胞分成空白對照組(使用無血清DMEM/F12培養液培養)、模型組(含5 μmol/L Aβ1-42的無血清DMEM/F12培養液培養)、綠萼梅各濃度不同洗脫部位組(含5 μmol/L Aβ1-42和1、10、100 μg/mL綠萼梅洗脫部位的無血清DMEM/F12培養液培養)，繼續孵育48 h。

2.1.4 MTT測定細胞存活率 孵育結束前4 h，每孔加入20 μL MTT溶液(PBS稀釋配置5 mg/mL)。孵育結束后，棄去各孔上清液，每孔加入150 μL DMSO，細胞振蕩儀上振蕩10 min，待結晶物充分溶解后使用酶標儀在570 nm測定各孔吸光度值OD570。

2.2 UPLC-Q-TOF/MS鑒定活性部位成分

2.2.1 供試品溶液的制備 分別取ST-60及ST-90適量，精密稱定。置于5 mL容量瓶中，加入50%的甲醇定容至刻度，超聲溶解，制成每毫升含1 mg的樣品溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，續濾液作為供試品溶液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱為Thermo Syncronis C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)。洗脫梯度：0～6 min，6%→9% A；6～12 min，9%→13% A；12～16 min，13%→13% A；16～26 min，13%→30% A；26～36 min，30%→40% A；36～38 min，40%→6% A；38～43 min，6% A；進樣量2 μL。

2.2.3 質譜條件 ESI離子源，正負離子模式，樣品錐電壓為40 V，源溫120 ℃，脫溶劑氣溫度450 ℃，脫溶劑氣體積流量為800 L/h。采用MSE采集方式，采集時間30.0 min，質荷比(m/z)100～1 200，掃描間隔0.1 s。碰撞能量：碰撞低能量6 V，碰撞高能量為10～35 V。碰撞氣為高純He，霧化氣為高純N2。Lockmass采用亮氨酸-腦啡肽，m/z556.276 6(正離子模式)、554.2615(負離子模式)。數據采集由MassLynx V 4.1軟件控制。采用Waters UNIFI軟件分析其中各化學成分的保留時間及其質譜信息，并結合其分子離子峰與對照品、文獻報道的數據進行對比，再對其中的化學成分進行辨識。

3 結果

3.1 活性部位篩選實驗 綠萼梅抗Aβ毒性作用部位篩選實驗結果見圖1，與空白對照組比較，模型組細胞存活率顯著下降(P<0.05)，說明Aβ誘導的SH-SY5Y細胞模型細胞存活率顯著降低。與模型組比較，綠萼梅各濃度不同洗脫部位組細胞存活率均顯著上升(P<0.05)，且高濃度不同洗脫部位組細胞存活率大于中、低濃度不同洗脫部位組，說明綠萼梅不同洗脫部位的藥效具有濃度依賴性；ST-60和ST-90提高細胞存活率的效果強于ST-0與ST-30。因此選擇ST-60和ST-90進行化學成分分析。

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 綠萼梅活性部位辨識 在中國知網、PubChem等數據庫中查詢并匯總綠萼梅(含梅花)的化學成分，建立包含化合物名稱、分子式、相對分子質量等信息在內的綠萼梅成分的一級質譜數據庫。根據綠萼梅抗Aβ活性作用部位實驗結果選取ST-60和ST-90進行定性分析。其中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷通過與標準品比對保留時間及二級質譜信息進行結構鑒定；其他化合物通過與UNIFI軟件和數據庫的自動匹配，結合前期研究基礎及文獻報道的特征質譜信息進行結構鑒定。從ST-60、ST-90中共鑒定出24個化合物，其中黃酮類16個，苯丙素類4個，其他類化合物4個；其中14個共有化合物，包括黃酮類10個，苯丙素類2個，其他類化合物2個。ST-60和ST-90正負模式總離子色譜圖(total ion chromatogram，TIC)見圖2，成分鑒定結果見表1。

表1 ST-60和ST-90的化學成分解析結果

注：A為ST-60正離子模式下TIC，B為ST-60負離子模式下TIC，C為ST-90正離子模式下TIC，D為ST-90負離子模式下TIC

4 討論

Aβ是由膜蛋白淀粉樣蛋白前體蛋白經過β分泌酶和γ分泌酶依次水解產生，具有神經毒性[14]，能使自由基的產生增多[15]，對神經細胞產生氧化應激作用，引起炎癥反應，是誘發AD的重要病因之一[16]，因此降低Aβ對神經細胞的損傷是治療AD的重要途徑。SH-SY5Y細胞常用來制備研究神經細胞凋亡的擬神經細胞模型，廣泛應用于神經細胞退行性疾病的發病機制和治療方法的研究[17]。本實驗結果顯示，ST-60和ST-90對Aβ蛋白誘導的SH-SY5Y細胞模型活性強于其他洗脫部位，且藥效呈現濃度依賴性，說明綠萼梅具有抗Aβ活性作用。經UPLC-Q-TOF-MS辨識ST-60和ST-90的化學成分，共鑒定出24個化合物，其中黃酮類16個，苯丙素類4個，其他類化合物4個。從兩個洗脫活性部位中鑒定出14個共有成分，分別為蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素和柚皮素等10個黃酮類化合物，綠原酸和反式羥基肉桂酸等2個苯丙素類化合物，以及腺苷和十六碳二烯酸等2個其他類化合物。結果表明，綠萼梅抗Aβ活性作用的藥效物質基礎可能是黃酮類化合物。