可溶性環氧化物水解酶2基因與中國漢族人群非綜合征型唇腭裂的關聯研究

楊夢夕 王藝儒 殷斌 鄭謙 石冰 賈仲林

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心四川大學華西口腔醫院唇腭裂外科，成都 610041

唇腭裂（cleft lip with or without cleft palate，CL/P）是一種先天性顱面部缺損的多基因遺傳病，在我國其發病率約為1.67‰，西南地區發病率位居全國第二，約為1.97‰[1]。唇腭裂的防治是我國出生缺陷防控重點之一，探究唇腭裂的發病機制將為該疾病的預防提供科學依據。

根據是否伴發有其他部位的先天畸形可將唇腭裂分為非綜合征型唇腭裂（non-syndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）和綜合征型唇腭裂（syndromic cleft lip with or without cleft palate，SCL/P），其中NSCL/P 約占70%[2]。SCL/P遵循孟德爾遺傳規律，屬于單基因遺傳病。而NSCL/P 的病因非常復雜，涉及多個基因、環境因素以及基因和環境的交互作用[3]。早期通過連鎖研究以及基于全基因組連鎖研究的Meta 分析[4]發現，8p21區域的差異具有統計學意義。此外，針對220個菲律賓NSCL/P 大家系進行的全基因組連鎖分析[5]發現，8p11-23 區域和NSCL/P 的相關性具有統計學意義，可溶性環氧化物水解酶2 基因（soluble epoxide hydrolase 2 gene，EPHX2）是該區域內具有統計學意義的基因。隨后，隨著全基因組關聯研究（genome wide association study，GWAS）技術在NSCL/P 的遺傳研究方面被廣泛應用，學者們報道了17 個GWAS，發現了50 多個NSCL/P的易感位點/基因，其中包括干擾素調節因子6、同源異性盒基因1、甲狀腺轉錄因子1 等，EPHX2基因是其中之一[6-14]。Ludwig 等[15]的GWAS 報道了位于EPHX2基因上的rs6558002 與歐洲和亞洲人群NSCL/P 相關。Gowans 等[16]在撒哈拉以南的非洲人群中進一步探究了rs6558002 與NSCL/P 的關聯性。

然而，GWAS 雖然成功解釋了NSCL/P 部分遺傳病因，但所關注的常見變異僅占復雜疾病遺傳因素的一小部分，未發現的遺傳因素可能包括基因組中廣泛存在的低頻/罕見變異。此外，常見變異對疾病的影響有限，就嚴重程度和較早發作而言，罕見變異對疾病的影響可能更大[17-18]。隨著測序技術的不斷發展，二代測序為復雜疾病的遺傳學研究提供了新的契機，它既能覆蓋常見變異，又能檢測罕見變異[19-20]。與一代測序技術相比，二代測序實現了對基因組序列的平行測序，能同時檢測百萬條序列，測序速度更快且費用更低，可以對基因組進行更全面地分析[21]。在二代測序中，針對特定區域進行測序的方式稱為目標區域捕獲測序，該技術不僅能捕獲目標區域獲得較全面的常見變異和罕見變異信息，而且測序時間較短和經濟成本較低，是深度挖掘疾病候選基因的有效手段。本課題在中國漢族人群NSCL/P中對EPHX2基因所在單倍型區域進行了目標區域捕獲測序，以便能夠全面、完整地篩查該區域的常見易感位點和低頻/罕見變異，進一步深入探究EPHX2基因與NSCL/P的相關性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

病例組收集2016年2月—2018年12月于四川大學華西口腔醫院唇腭裂外科住院手術治療的159個NSCL/P 病例，包括79 名非綜合征型單純唇裂（non-syndromic cleft lip only，NSCLO）患者和80名是非綜合征型唇裂伴腭裂（non-syndromic cleft lip and palate，NSCLP）患者（表1），所有研究對象均屬于中國漢族人群，且符合先天性NSCL/P 診斷標準，不合并其他先天畸形或先天性疾病。

表1 NSCL/P患者的臨床特征Tab 1 Clinical characteristics of patients with NSCL/P

對照組來自諾禾致源基因數據庫（http://www.novogene.com/）的542 名中國漢族健康人的全基因組測序數據。該研究獲得華西口腔醫院倫理委員會批準（批件號：WCHSIRB-D-2016-012R1）。

1.2 目標區域的捕獲和測序

1.2.1 捕獲目標測序區域 結合HapMap 數據庫中亞洲人群（中國北京漢族人群和日本東京人群）的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）結構，在chr8:27359373-27410543（GRCh37/hg19）區域（圖1）進行目標區域捕獲測序。該部分實驗委托諾禾致源公司進行，基因組DNA 片段化和文庫質量檢測后，用安捷倫SureSelectXT定制試劑盒富集捕獲目標區域序列，通過Illumina Hiseq 4000 進行雙末端測序，每端讀取堿基序列長度為150個堿基對。

圖1 目標測序區域chr8:27359373-27410543（GRCh37/hg19）Fig 1 Target sequencing at chr8:27359373-27410543(GRCh37/hg19)

1.2.2 生物信息分析 首先對測序得到原始數據進行初步過濾，再用國家微生物科學數據中心的BWA軟件把過濾后的數據和參考基因組進行比對；生成相應文件后，使用SAMtools 軟件對該文件得到的數據進行排序，重復序列通過Picard軟件來進一步處理；再使用SAMtools 和BCFtools 等軟件來識別單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點和插入缺失；運用ANNOVAR 進行注釋，通過dbSNP、1000 Genome、ExAC、HGMD等數據庫獲得變異的位置、類型和保守預測等信息；非同義突變通過CADD、SIFT、PolyPhen2 和MutationTaster這4個軟件進行有害性預測。

1.3 統計分析

按照變異位點最小等位基因頻率分為2類：常見變異的最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）≥0.01 和罕見變異的MAF＜0.01[17]。對符合哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）檢驗的常見變異，使用PLINK 軟件進行關聯分析。

對符合以下2條納入標準的罕見變異進行負荷分析：1）在1000 Genome 數據庫和諾禾致源數據庫的中國北京漢族人群及中國南方漢族人群中MAF＜0.01；2）GnomAD 數據庫中MAF＜0.001。經SIFT、PolyPhen2，MutationTaster 和CADD 這4 個軟件進行預測，上述預測軟件中最少有2個軟件顯示是有害突變。

2 結果

2.1 測序結果

通過對chr8:27359373-27410543（GRCh37/hg 19）區域進行捕獲測序，共發現了192個單核苷酸變異位點及45 個插入缺失突變，根據這些變異位點的MAF分為常見變異和罕見變異。

2.2 常見變異的關聯分析結果

將所有通過HWE 檢驗的常見變異位點納入關聯分析，結果發現：有5 個SNP 位點與NSCL/P 相關；其中位于EPHX2 基因外顯子區的rs57699806與NSCL/P 具有關聯性[P=0.000 13，比值比（odds ratio，OR）=2.849，95%置信區間（confidence interval，CI）：1.691～4.800]其次是位于基因間的rs-4732723（P=0.006 50，OR=0.662，95%CI：0.491～0.892），內含子區的rs7829267（P=0.009 20，OR=1.496， 95%CI： 1.117～2.005）， rs721619 （P=0.011 00，OR=1.474，95%CI：1.098～1.980）和rs-7816586（P=0.040 00，OR=1.310，95%CI：1.015～1.691）（表2和圖2）。

圖2 EPHX2基因的SNP與NSCL/P關聯分析的LD分布圖Fig 2 LD Plot of the SNPs at EPHX2 gene for NSCL/P association analysis

表2 EPHX2基因區域常見變異與NSCL/P的關聯分析Tab 2 Association analysis between common variations in the EPHX2 gene region and NSCL/P

2.3 罕見變異的負荷分析結果

罕見變異負荷分析結果顯示，病例組和對照組的差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 功能預測

對常見變異關聯分析中的SNP 位點rs576998-06 進行了功能預測，結果發現，rs57699806 為A等位基因時，可以改變2 個轉錄因子的結合位點GATA_disc4和Mxi1_known1（表3）。

表3 rs57699806 為A 等位基因改變的轉錄因子結合位點Tab 3 rs57699806 is the transcription factor binding site changed by A allele

3 討論

EPHX2基因具有功能多樣性[22]，它是否會影響頜面部的發育仍有待進一步的探索。頜面部的發育是一個復雜的過程，涉及神經嵴細胞的增殖、分化和遷徙，面部的突起在特定的時間和空間里生長、融合或聯合，該過程由多種信號分子共同

參與調節，若發生變化可能會引起頜面畸形[23-24]。本研究采用目標區域捕獲測序技術進一步篩查EPHX2基因區域的常見變異和罕見變異，并分別進行了關聯分析和負荷分析。通過常見變異的關聯分析，發現了該區域5 個與NSCL/P 相關的SNP位點。其中，位于EPHX2 基因外顯子區的rs57-699806 具有統計學意義（P=0.000 13，OR=2.849，95%CI：1.691～4.800）。當rs57699806 突變為A 等位基因時，可以改變GATA_disc4 和Mxi1_known1 2 個轉錄因子的結合區域。GATA 家族成員包括GATA1～6，參與胚胎早期細胞分化和器官發育，大多數GATA家族成員的突變可導致人類發育性疾病[25]。其中GATA 4 參與神經嵴細胞和頜面部骨骼的生長發育，GATA4 缺失可以導致細胞的增殖減少，條件性敲除Gata4基因的小鼠出現了下頜骨、額骨、硬腭的礦化減少以及牙齒形態變小，敲低斑馬魚胚胎gata4基因的表達也出現了類似上述小鼠模型的形態特征，斑馬魚的下頜弓變得短小[26]。另一個GATA 家族成員GATA6，GATA6 的下調參與介導地塞米松誘導腭裂的過程，可能與腭突細胞的凋亡有關[27-28]。Mxi1 是Mad 轉錄家族（包括Mad1、Mxi1、Mad3、Mad4、Mnt 和Mga） 成員之一，通過Myc/Max/Mad網絡來調控細胞的增殖、分化和凋亡[29-30]。Mxi1 對調控正常細胞生長、誘導和維持細胞分化至關重要[31]。盡管沒有直接證據顯示Mxi1 與唇腭裂的關聯，但Mad 轉錄家族中同樣參與Myc/Max/Mad 網絡調控的Mnt基因的敲除可導致小鼠出現不同程度的腭裂和顱骨發育遲緩[32]。

通過目標區域捕獲測序在EPHX2基因區域發現了5 個與NSCL/P 相關的SNP 位點（rs57699806、rs4732723、 rs7829267、 rs721619、 rs7816586），其中rs721619 在之前的全基因組連鎖分析[5]中已有報道，其余4個位點為新發現位點。罕見變異負荷分析結果顯示病例組和對照組的差異無統計學意義，這可能是由于罕見變異在人群中出現的頻率較低，在當前研究樣本量較小的情況下，不易檢出而導致陰性結果。罕見變異在NSCL/P 等復雜疾病的發生過程中發揮非常重要的作用，近些年的研究結果顯示，越罕見的遺傳變異疾病致病性越強，在將來的研究中非常有必要納入更多人群樣本來檢測罕見變異，完善NSCL/P 易感位點突變譜，為以后唇腭裂的分子診斷和遺傳咨詢奠定基礎。

綜上，本研究發現中國漢族人群EPHX2基因單核苷酸多態性與NSCL/P 的發生存在相關性。雖然EPHX2基因區域罕見變異的負荷分析結果在兩組的差異無統計學意義，不過就目標區域捕獲測序技術本身而言，該技術為基因組中廣泛存在的罕見變異的篩查提供了契機，能更全面地揭示影響復雜疾病發生的遺傳因素。本研究為EPHX2基因與NSCL/P 之間的關聯提供了新的證據，但還需要在其他大樣本人群研究中驗證，EPHX2基因是否參與了頜面部的發育過程，仍需通過功能研究來揭示其在調控網絡中的角色。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。