低溫等離子體促進人牙齦上皮細胞在鈦表面的黏附

張敏 敖小剛 鄭錚 陳文川

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心四川大學華西口腔醫院修復科，成都 610041

種植修復因其突出的優點成為牙列缺損或缺失患者主要選擇的修復方式。Br?nemark 等[1]首次提出“骨結合”的概念，認為骨結合是種植體修復成功的關鍵。然而，種植修復的長期穩定性除與骨結合相關外，軟組織與種植體基臺之間的生物封閉也起到至關重要的作用[2]，并對遠期成功率有重要意義。從解剖上看，種植體周圍的軟組織封閉主要由兩方面組成：上皮組織封閉與纖維組織封閉。上皮組織封閉位于纖維組織封閉上方，與口腔環境直接接觸，是抵抗外界環境中有害物質侵入種植體的第一道屏障。種植體周圍上皮（peri-implant epithelium，PIE）是種植體周圍軟組織生物封閉的關鍵：與結合上皮（junctional epithelium，JE）類似，PIE 通過半橋粒（hemidesmosomes，HDs）和基底板（internal basalt lamina，IBL）附著于種植體表面[3-4]。

然而，與JE 相比，PIE 的封閉能力相對較弱，形成時間較長，易受到細菌外界刺激的攻擊[5]。因此，近年來學者們也開展了諸多研究，主要針對種植體基臺表面的改性，包括基臺的涂層[3,6]、選擇性激光燒結[7]、極化處理[8]、直接等離子體噴涂[9]。雖然在這些方面取得了一些積極的進展，但在臨床中應用改性的鈦基臺的技術尚未成熟。其主要原因是改性后的基臺增加人牙齦上皮細胞（human gingival epithelial cells，HGECs） 黏 附 的同時，也可能增加細菌在基臺表面定植的風險，其有效性有待進一步證實[10]。

考慮到這些局限性，從細胞角度思考，通過一種特殊且安全的方法來提高牙齦上皮細胞的黏附相關活性成為一種可靠方案。近年來，低溫等離子體（non-thermal atmospheric plasma，NTAP）已廣泛應用于生物醫學工程，包括傷口愈合[11-12]、癌癥治療[13]、創口止血[14]、干細胞分化[15-16]、組織再生[17-18]、殺菌[19-20]、牙齒美白[21]、根管治療[22]等方面。Langmuir[23]在1927年首次提出術語“低溫等離子體”，定義為一種電離氣體，它電離時溫度接近室溫，這是能直接處理活細胞的理論基礎[24-25]。Lou 等[11]研究發現，He/Ar-NTAP 通過激活上皮-間充質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）和細胞周期進程能有效誘導角質形成細胞的增殖和遷移。同時，基于本課題組之前的研究[26]，發現NTAP 可以作為牙周炎治療的補充療法，有效去除根面及袋內的生物膜。

鑒于NTAP 這些積極作用，探索NTAP 是否對HGECs 在鈦表面的黏附也具有促進作用。因此，本研究采用NTAP 處理HGECs 細胞，然后在掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）下直接觀察細胞黏附情況，并研究HDs 和IBL 中黏附相關蛋白層粘連蛋白α3（Laminin α3）、整合素蛋白β4 （Integrin β4） 和網蛋白（Plectin） 的變化。

1 材料和方法

1.1 鈦片的制備

本研究使用的四級工業純鈦（成都欣航豐科技有限公司），直徑15.0 mm 或34.0 mm，厚度為1.0 mm。它們依次經粒度200、400、600、800、1 200 和2 000 號的SiC 砂紙進行打磨拋光，然后在超聲震蕩下，用丙酮、75%的乙醇和蒸餾水分別處理15 min，重復3 次。最后，樣品在60 ℃真空干燥，消毒24 h后備用。

1.2 細胞培養

HGECs 購自于上海滬震生物科技有限公司，在四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室培養和保存。HGECs 在口腔角質細胞培養基（oral keratinocyte medium，OKM）（ScienCell 公司，美國）中培養，加入1%青霉素/鏈霉素溶液（Hyclone 公司，美國）。這些細胞在37 ℃、5%CO2的孵箱中傳代培養。取生長狀態良好的2～3 代，0.25%胰酶溶液進行消化，放置于孵箱中1 min 后加入含血清的培養基終止消化，1 000 r·min-1下離心5 min，棄上清，培養基重懸，顯微鏡下計數板計數，調整細胞濃度至每毫升1×105個，接種于35 mm 培養皿并加入適量OKM培養基。

1.3 NTAP處理

該裝置由四川大學和美國密蘇里大學等離子體研究中心研發制造并提供。以氬氣（Ar）作為載體，流速3 000 sccm·min-1。氧（O2）作活性氣體，流速30 sccm·min-1。開啟電源啟動裝置，混合氣體經設計的手柄噴嘴生成非熱等離子火焰。在細胞處理過程中，每次實驗直接在培養皿中照射細胞。培養皿中含有相應密度（每毫升1×105個）的細胞懸液。直徑35 mm的培養皿中加入3 mL OKM培養基，NTAP 處理時，手柄噴嘴距離培養皿約10 mm。處理的過程中呈Z 形勻速移動手柄噴嘴，盡可能地達到均勻處理。照射后將細胞懸液混勻，接種于相應已放置鈦片的孔板。

1.4 篩選適宜的處理時間

HGECs分別經NTAP處理0、10、20、30、60 s后，接種于已放置鈦盤的24 孔板，細胞密度為每毫升1×105個，加入1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液。各組細胞分別孵育4 和24 h。在預設的時間點去除原有培養基，PBS輕輕洗滌3次。避光條件下，使用細胞計數試劑盒-8 （cell count kit-8，CCK-8）（東仁公司，日本）對細胞黏附的數量進行評估。在每個樣品孔中加入500 μL 新鮮配制含10%的CCK-8試劑的OKM 培養液，然后在細胞培養箱中繼續避光培養2 h。最后，輕輕水平搖晃孔板混勻反應液，從每個孔中吸取100 μL 溶液到無菌96 孔板內，每個樣品孔均設置3個復孔，測定在450 nm處的光密度（optical density，OD）值。

1.5 最佳處理時間下細胞黏附數量

將接受最佳NTAP處理時間（Plasma組，結果參考1.4）或未接受NTAP 處理的HGECs（Control組）以密度為每毫升1×105個接種于24孔板的鈦表面，培養方式同1.4，分別培養4、12、24 和48 h。在預設時間點去除原培養基，用PBS洗滌3次。使用CCK-8 對細胞進行評估。采用CCK-8 標準操作對結果進行檢驗。

1.6 最佳處理時間下細胞黏附和形態

接受最佳時間處理的Plasma 組和Control 組的HGECs 接種于24 孔板的鈦表面，細胞密度為每毫升1×105個，分別在培養4、12、24、48 h 時間點用2.5%戊二醛溶液固定12 h，PBS沖洗3次。然后在乙醇（35%、50%、75%、85%、95%、100%）中依次脫水，每次10 min。脫水后使用醋酸異戊脂溶液進行置換，臨界點干燥后對樣本進行噴金處理，最后將處理完成的樣本放置于SEM 下觀察細胞的黏附形態。細胞附著于鈦表面是實現軟組織封閉的第一步。

1.7 最佳處理時間下基因表達

接受最佳時間處理的Plasma 組和Control 組HGECs 分別以細胞密度為每毫升1×105個接種于6孔板的鈦表面，分別孵育4、12、24、48 h。取出相應培養時間點的孔板置于冰上進行操作。使用Trizol（北京索萊寶科技有限公司）法裂解細胞并提取總RNA。使用Prime Script RT Master Mix（TaKaRa 公司，日本）逆轉錄合成cDNA，然后使用Light Cycler 480（Roche 公司，瑞士）與SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa 公司，日本）進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）。以HGECs的引物為模板，采用Laminin α3、Integrin β4 和Plectin 特異性引物進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR），磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，所用引物序列見表1。

表1 qRT-PCR的引物序列Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.8 最佳處理時間下的蛋白表達

Plasma 組和Control組的HGECs 接種于直徑為34.0 mm 鈦盤的6 孔板。同樣，細胞培養4、12、24和48 h后。樣品用PBS洗滌，用含有1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）（北京索萊寶科技有限公司）的RIPA 裂解液（radio immunoprecipitation assay，RIPA）（北京索萊寶科技有限公司）吹打裂解，BCA 法測定蛋白濃度。將蛋白樣品轉移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Roche 公司，瑞士）上、5%脫脂牛奶在TBST 緩沖液中封閉2 h，然后用抗Laminin α3、抗Integrin β4 或抗Plectin 在4 ℃下孵育過夜。用TBST 沖洗，然后用相應的二抗IgG-HRP（上海Abcam公司）室溫孵育1 h。最后，用電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）（Bio-Rad 公司，美國）溶液顯影，然后在膜上曝光1 min，采集條帶，采用quantity one 分析膠片的灰度值。

1.9 數據分析

采用SPSS 24.0 軟件包對所有定量結果進行分析。采用單因素方差分析（ANOVA）進行統計分析，然后采用Student Newman Keuls（ANK）方法確定多重比較的顯著性差異。P＜0.05 被認為有統計學意義。

2 結果

2.1 NTAP的最佳處理時間

不同NTAP 處理時間下HGECs 在鈦表面的黏附結果見圖1。培養4 h 時，與0 s 組相比，10、20、30 s 組細胞黏附數量明顯增加。然而，60 s 組出現了下降。不同組間，20 s照射對促進細胞黏附作用最大，與其他組比較差異有統計學意義（P＜0.05），其中OD值為0.32±0.03，而對照組OD值為0.19±0.01。培養24 h 時，HGECs 黏附數量增加趨勢相似，HGECs 黏附在20 s 處理時達到最大值，OD 值為1.02±0.10，與其他組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。以上2 個時間點的細胞培養結果顯示，HGECs 在照射20 s 時黏附數量達到最大，因此選擇20 s作為下一次實驗的最佳處理時間。

圖1 不同NTAP作用時間對HGECs黏附的影響Fig 1 Effects of different NTAP treatment time on the adhesion of HGECs

2.2 細胞黏附實驗

20 s 為實驗的最佳處理時間，故Plasma 組采用20 s 處理時間。隨著培養時間的延長，不同組HGECs 在鈦表面上的附著和生長均不斷增加，呈時間依賴性。Plasma 組細胞黏附率顯著高于對照組（P＜0.05）（圖2）。實驗結果表明，NTAP 處理后培養4、12、24、48 h，HGECs 在鈦表面上的黏附和增殖比對照組分別增加了1.7、1.5、1.6 和1.5倍。

圖2 HGECs在鈦表面培養不同時間的黏附Fig 2 Adhesion of HGECs on titanium surface at different times

2.3 細胞形態學觀察

SEM 觀察不同組HGECs 黏附在鈦表面不同的細胞形態。培養4 h，2 組細胞均呈收縮聚集狀，黏附面積小，黏附松散，胞體無細胞偽足伸出。培養12 h，2 組進一步伸展，但Plasma組細胞顯示較大粘連面積。在更高倍鏡的視野下觀察，細胞顯示出更大的伸展面積，細胞更加扁平，周圍更多的絲狀偽足錨定在鈦片表面。培養24 和48 h，2組HGECs均進一步伸展，表現為不規則的多邊形，有更多的觸角和偽足。Plasma 組的HGECs 比對照組顯示鋪展面積更大，偽足數量多和廣泛的細胞相互連接（圖3）。

圖3 SEM觀察HGECs細胞的形態Fig 3 SEM observation of the morphology of HGECs

2.4 qRT-PCR 評價Laminin α3、Integrin β4 和Plectin基因的表達

HGECs 黏附在鈦表面上4、12、24 和48 h 的Laminin α3、Integrin β4 和Plectin 基因表達分析結果見圖4。與Control組相比，Plasma 組Laminin α3 mRNA 表達明顯增加。12、24 和48 h 時，可以觀察到相似的表達結果，且Laminin α3 mRNA 表達均持續升高。Integrin β4 是HGECs 黏附早期表達的標記基因。在不同的時間內，Integrin β4 基因表達在NTAP 處理后顯著增加。在4～48 h，2 組間差異均有統計學意義。在孵育4、12、24和48 h后測定Plectin的表達，NTAP 處理增加其表達水平，趨勢同Laminin α3和Integrin β4。

圖4 qRT-PCR檢測HGECs的基因表達水平Fig 4 Gene expression levels of HGECs detected by qRT-PCR

2.5 Western blot 分 析Laminin α3、Integrin β4 和Plectin的表達

黏附鈦表面的細胞通過Western blot 分析HGECs 中Laminin α3、Integrin β4 和Plectin 的蛋白表達水平（圖5）。首先培養4 h 時，Plasma 組的3組基因的表達量均高于Control 組，條帶灰度定量后測得分別為1.8、2.5 倍和1.35 倍。培養12 h 時，Plasma 組Laminin α3、Integrin β4 和Plectin 分別增加1.2、1.7 和1.4 倍。然而，考慮到NTAP 的作用時間較為短暫（僅20 s），24 h 和48 h 組的差異則不如早期階段明顯。與對照組相比，Plasma 組顯著上調HGECs 中早期（12 h）的Lamininα3、Integrin β4 和Plectin 的表達水平，結果與基因表達基本一致。后期差異不明顯，可能提示：細胞內的蛋白并非單一因素（NTAP）調控，深入的調控機制還需要進一步研究。

圖5 Western blot檢測HGECs不同時間的蛋白表達水平Fig 5 Western blot detection of protein expression levels in HGECs at different times

3 討論

一直以來，眾多學者都認為骨結合的成功是種植體的存活準則。但近來，越來越多的臨床證據表明，健康穩定的種植體周圍軟組織結合同樣是重要因素。第一道生物屏障的生物封閉能抵抗細菌及其代謝物的侵襲，有利于其下方的骨結合的穩定，保證種植的長期成功率。種植體周圍的上皮封閉主要是通過PIE黏附在鈦表面形成，其黏附數量的多少和緊密程度與封閉能力密切相關。

在種植體周圍上皮封閉的細胞黏附過程中，參與的主要黏附蛋白為Laminin 332（又稱Laminin-5）、Integrin α6β4 和Plectin。Laminin 332 主要由α3、β3 和γ2 三條鏈組成。研究[27]表明，在Laminin 332 的組裝過程中，β3γ2 二聚體首先在細胞內合成，然后再與α3 基團進行整合形成三聚體。因此，α3 基團的合成是Laminin 332 三聚體組裝過程中的關鍵因素，提高α3 的表達可促進細胞內Laminin 332 的合成。PIE 形成早期，Laminin 332在上皮與結締組織交界處，而有研究[28]發現PIE 形成后，可在上皮與種植體之間檢測到其存在，推測Laminin 332 可引導上皮向種植體表面遷移，形成HDs并促進生物學封閉。而Integrin α6β4是一種非共價異二聚體，是HDs的跨膜部分，也是Laminin 332的重要受體。本研究僅檢測了Integrin β4的表達差異變化，是因為研究表明Integrin α6β4的β4尾部的胞外段能夠識別與Laminin α3 的COOH 端的LG 區特異性結合，具有高親和力，調節細胞的黏附。研究[29]表明β4 在參與細胞間、細胞與基質間的行為調控比α6 更具有重要作用。Plectin 是一種相對分子質量為500 000 膜蛋白，是細胞骨架多功能的連接劑，調節微絲、微管、中間絲的錨定功能，與上皮層的基底膜細胞層具有廣泛的聯系[27]。它們一起構成類似HDs和IBL的結構，有助于PIE固定在種植體表面。

本研究采用一種新的方法體外處理HEGCs，并在分子和細胞水平上檢測細胞的變化。在本實驗中，鈦片模擬種植體的穿齦部分的純鈦基臺。當HGECs 與鈦表面發生接觸時，細胞會發生一系列的生理反應，如細胞黏附、伸展和遷移等。而這其中，細胞黏附發生得最早。選擇Ar作為載氣，這與以往的研究[30]報告一致：大多數等離子體射流裝置使用惰性氣體（He 或Ar）作為工作氣體，通常摻雜少量分子氣體（N2、O2）。NTAP 處理后，細胞發生黏附、伸展、連接、分泌等一系列生理反應。一般來說，低劑量具有殺菌、刺激細胞、促進增殖和遷移。Kalghatgi 等[31]報告說，低劑量NTAP（30 s 或4 J·cm-2）對內皮細胞相對無損傷，而長時間暴露（60 s 或8 J·cm-2）會導致不可逆且永久性的細胞損傷甚至死亡。Lou 等[11]研究表明，等離子體（工作電壓6.5 kV，與培養基表面距15 mm，He/Ar 混合比例為10∶1）能有效激活細胞增殖。本研究中使用的NTAP 的參數（1%O2/Ar，3 000 sccm·min-1）是基于前期的工作[26]，其結果驗證有效，且對大鼠健康牙齦組織無不良影響。本研究發現，黏附在鈦表面的HGECs 的數量比對照組要高，而這種差異在培養數小時后變得顯著。SEM 結果顯示，NTAP 處理后的HGECs 呈多角形，突起較多，表面積較大，伸長較大。進一步檢測NTAP 促進牙齦上皮細胞黏附相關基因（Laminin α3，Integrin β4 和Plectin）的表達，正如推測的那樣，NTAP 可促進HGECs 的黏附。純鈦-上皮細胞界限的生物學評價：細胞黏附率和細胞在純鈦界面的超微結構形態是評價材料表面細胞相容性的基本方法。PCR 和Western blot 技術分別從蛋白水平和基因水平檢測目的基因的表達情況。

NTAP 在生物醫學領域中對各種生物材料的影響均有廣泛研究，經證實，它對正常細胞也有積極作用[12,32]。實驗中使用的NTAP 的氣體溫度為27 ℃，因此針對細胞的熱效應可以排除。此外，培養基的液體層可以阻擋紫外線對細胞的直接輻射。本實驗中NTAP僅直接照射細胞一次，但在短時間試驗中便證明NTAP 的處理具有統計學意義。因此，在對細胞相對無損傷的情況下，反復NTAP照射的效果是否能維持更長的時間還有待于闡明。等離子體高度復雜的相互化學作用，反應活性物質被引入或在培養基中產生以及發生二次級聯反應[33]。然而，這些高活性分子難以分析。一是因為活性分子存在時間短暫，另一原因是它們會相互作用。在接下來的工作中，需要對NTAP的成分進行精確的機理分析。不可否認的是，目前的研究仍然提供了初步證據，證實NTAP具有可以早期促進上皮細胞黏附和維持生物封閉的潛力。NTAP是一種電離的氣體介質，它容易進入常規儀器無法通過擴散到達狹窄、不規則的孔隙和裂縫中，進而達到臨床治療的目的。鑒于基臺材料的NTAP表面改性的局限，這種方法可以與其他基臺表面改性策略相結合，并可能實現疊加和協同效應。

綜上所述，雖然本研究存在一些局限性，但可以得出一些重要的結論。研究發現，與未使用NTAP 處理的相比，一定時間的NTAP 處理能促進HGECs 在鈦表面的黏附以及相關黏附相關基因（Laminin α3、Integrin β4 和Plectin）的表達增加。結果表明，NTAP 是提高種植體周圍黏膜屏障的生物封閉很有前景的方法。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。