基于線粒體Cytb和COⅠ基因的洞庭湖區養殖克氏原螯蝦遺傳多樣性分析

歐琳 張余 陳曉芳 周剛 黃宇宏 陳蕾 肖調義 劉巧林

(湖南農業大學 湖南省特色水產資源利用工程技術研究中心，湖南長沙 410128)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱小龍蝦，隸屬于節肢動物門、甲殼綱、十足目、螯蝦科、原螯蝦屬，原產于美國，現已成為我國重要的淡水養殖蝦類[1-5]。該蝦肉質鮮美，營養豐富，深受市場歡迎，是近幾年夏季消費的“網紅”產品[6-7]。湖南省是我國克氏原螯蝦的主要養殖省份之一，小龍蝦養殖已成為當地產值超百億元人民幣的特色新產業，其中洞庭湖區的益陽、岳陽、常德等3市為主要產區。克氏原螯蝦種質資源的研究對其保護和利用、提高養殖產量、良種選育等具有重要意義[8]。開展對克氏原螯蝦群體遺傳結構及遺傳變異的相關研究，有助于豐富其種質資源多樣性，保證相關產業的可持續發展。

近年來，分子生物學技術不斷發展，不僅被國內廣大學者廣泛應用于水生生物遺傳學分析[9-13]，還被國外學者大量應用于水產動物遺傳育種研究[14-18]。動物的線粒體DNA分子量較小，結構相對穩定，進化速度較快，遵循嚴格的母系遺傳，是進行群體研究的理想材料[19]。其中，細胞色素b(Cytb)基因和細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因的長度和進化速率適宜，常被用于群體遺傳學研究[20-23]。本研究基于以上兩種基因，對洞庭湖區岳陽華容縣和益陽南縣2處主養殖區共11個采集點的克氏原螯蝦群體進行了遺傳多樣性分析，以期豐富克氏原螯蝦種質資源的研究數據，為洞庭湖區克氏原螯蝦的綜合養殖和育種研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

樣本采集點參照當地畜牧水產局提供的養殖小龍蝦大戶或合作社名單確定。在岳陽市華容縣選取6個采集點，共計180個樣本；益陽市南縣選取5個采集點，共計150個樣本。樣本個體健壯，生長良好，附肢齊全，顏色呈暗紅或黑紅，體表光澤度好。剪取樣本的肌肉組織，置于1.5 mL離心管中，-80 ℃冷凍保存。

1.2 DNA提取

根據Tissue DNA Kit(D3396-01)試劑盒上的說明提取樣本DNA。

1.3 Cytb和COⅠ基因擴增與測序

反應引物及序列見表1。PCR反應體系為：1 μL DNA，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，10 μL 2×TaqDNA poly-merase Mix，8 μL ddH2O。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35次循環；72 ℃延伸5 min，于4 ℃保存。

表1 基因擴增引物

將得到的產物用加入1%瓊脂糖凝膠液的凝膠板通電進行電泳(60～100 V，40 min)，電泳完畢后，將凝膠進行染色，用凝膠成像系統拍照保存。

將含有目的條帶的產物送到武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進行雙向測序。

1.4 數據處理

測序所得各片段用GENEIOUS 9.13軟件進行序列的雙向拼接并校對，排查刪除錯誤片段，截取等長的有效片段，導出fasta文件用于后期單倍型分析。通過DnaSp 5.0軟件進行遺傳多樣性參數分析。通過MEGA 7.0軟件采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構建系統進化樹，同時對11個采集點樣本之間的遺傳距離進行簡要分析。

2 結果

2.1 Cytb基因序列分析

2.1.1 堿基組成

經質量檢測，在所提取的克氏原螯蝦基因組DNA中，華容縣采集點獲得179個有效樣本，益陽南縣采集點獲得149個有效樣本。PCR擴增后，經雙向測序，測序結果經雙向拼接并校對，排查刪除錯誤片段后，截取等長的有效Cytb基因序列為762 bp，堿基平均含量由高到低依次為：T(34.08%)、A(31.08%)、C(18.51%)、G(16.33%)，其中A+T的含量(65.16%)明顯高于G+C的含量(34.84%)。這說明11個采集點的克氏原螯蝦在Cytb基因的堿基組成上表現出一定的偏向性。

2.1.2 遺傳多樣性參數

11個采集點Cytb基因的遺傳多樣性參數見表2。結果表明，11個采集點的克氏原螯蝦的遺傳多樣性指數略有差異，華容縣6個采集點克氏原螯蝦的遺傳多樣性指數要高于南縣5個采集點的，總體表現出較低的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性。

表2 11個采集點Cytb基因的遺傳多樣性參數

2.1.3 單倍型分布及系統進化樹

在不包含空白與缺失位點的檢測下，11個采集點共檢測出5個單倍型(見表3)。其中，南縣5個采集點的克氏原螯蝦群體存在3個單倍型，而華容縣6個采集點的克氏原螯蝦群體存在4個單倍型。結果顯示，Hap1、Hap3為11個采集點所共有，Hap2、Hap4為華容縣6個采集點所特有，Hap5為南縣5個采集點所特有，單倍型以Hap1(62.2%)為主。

表3 11個采集點Cytb基因單倍型在群體中的分布

基于Kimura 2-Parameter模型，以鄰接法構建克氏原螯蝦11個采集點Cytb基因的單倍型系統進化樹(見圖1)，設置檢驗次數為1 000次。結果顯示，Hap2和Hap3最先聚為1支，然后與Hap1聚為1支，接著與Hap4聚為1支，最后和Hap5聚為1支。結果表明，11個采集點的克氏原螯蝦群體聚類在一起，不存在明顯的遺傳分化。

注：HR表示華容縣樣本，NX表示南縣樣本。

2.1.4 遺傳距離

11個采集點Cytb基因的遺傳距離見表4。結果顯示，華容縣6個采集點的克氏原螯蝦的種內遺傳距離(0.551)大于11個采集點間的遺傳距離(0.535)，而南縣5個采集點的克氏原螯蝦的種內遺傳距離(0.519)相較于11個采集點間的遺傳距離又偏小。試驗表明，11個采集點之間不存在明顯的遺傳分化(P>0.05)。

表4 11個采集點Cytb基因的遺傳距離

2.2 COⅠ基因序列分析

2.2.1 堿基組成

PCR擴增產物經雙向測序、拼接校對，排查刪除錯誤片段后，截取等長有效COⅠ基因序列為847 bp，堿基平均含量由高到低依次為：T(40.00%)、A(26.90%)、G(18.55%)、C(13.50%)，其中A+T的含量(66.90%)明顯高于G+C的含量(32.05%)。這表明11個采集點的克氏原螯蝦COⅠ基因存在著明顯的T/A堿基偏向。

2.2.2 遺傳多樣性參數

11個采集點COⅠ基因的遺傳多樣性參數見表5。結果表明，11個采集點COⅠ基因的遺傳多樣性參數略有差異，華容縣6個采集點克氏原螯蝦的遺傳多樣性高于南縣5個采集點的克氏原螯蝦，總體表現出較低的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性。

表5 11個采集點COⅠ基因的遺傳多樣性參數

2.2.3 單倍型分布及系統進化樹

在不包含空白與缺失位點的檢測下，11個采集點共檢測出9個單倍型(見表6)。其中南縣5個采集點的克氏原螯蝦群體存在5個單倍型，而華容縣6個采集點的克氏原螯蝦群體存在6個單倍型。結果顯示，Hap1、Hap3、Hap7、Hap8、Hap9為11個采集點所共有，Hap4、Hap5為華容縣6個采集點所特有，Hap2、Hap6為南縣5個采集點所特有，單倍型以Hap1(86.1%)為主。

表6 11個采集點COⅠ基因單倍型在群體中的分布

基于Kimura 2-Parameter模型以鄰接法構建克氏原螯蝦11個采集點COⅠ基因的單倍型系統進化樹(見圖2)，檢驗次數設置為1 000次。結果顯示，克氏原螯蝦分為2大支，Hap1至Hap6聚為1大支，Hap7、Hap8和Hap9形成另1個大分支。結果表明，11個采集點的克氏原螯蝦群體之間并無明顯的遺傳分化。

注：HR表示華容縣樣本，NX表示南縣樣本。

2.2.4 遺傳距離

11個采集點COⅠ基因的遺傳距離見表7。結果表明，華容縣6個采集點克氏原螯蝦的種內遺傳距離(0.122)大于11個采集點間的遺傳距離(0.114)，而南縣5個采集點克氏原螯蝦的種內遺傳距離(0.099)相較于11個采集點間的遺傳距離偏小。結果表明，11個采集點克氏原螯蝦群體之間遺傳分化不顯著。

表7 11個采集點COⅠ基因的遺傳距離

3 討論

3.1 序列特征

本研究從線粒體Cytb和COⅠ基因序列分析入手，探討洞庭湖區養殖克氏原螯蝦的遺傳多樣性。經基因組DNA提取、PCR擴增、序列測定、序列拼接和序列比對分析，最終獲得的Cytb和COⅠ基因長度分別為762 bp和847 bp。在以上兩種基因的堿基組成中，A和T的總含量均明顯高于G和C的總含量。這表明克氏原螯蝦線粒體基因序列的堿基組成成分并不均一，具有較強的偏向性。在其他十足目物種中也存在同樣的規律[24-26]。導致這一現象的原因可能是基因長度和基因表達水平存在較大的差異。

3.2 遺傳多樣性

在遺傳多樣性參數中，單倍型多樣性指數和核苷酸多樣性指數常常被用來評價群體遺傳多樣性水平的高低[27-28]。本研究中，基于Cytb基因序列在華容縣的6個采集點中，克氏原螯蝦的單倍型多樣性指數為0.506，核苷酸多樣性指數為0.272 65；在南縣的5個采集點中，克氏原螯蝦的單倍型多樣性指數為0.467，核苷酸多樣性指數為0.259 74?；贑OⅠ基因序列在華容縣的6個采集點中，克氏原螯蝦的單倍型多樣性指數為0.258，核苷酸多樣性指數為0.136 1；在南縣的5個采集點中，克氏原螯蝦的單倍型多樣性指數為0.244，核苷酸多樣性指數為0.122 3。上述數據表明，11個采集點的克氏原螯蝦群體總體呈現出較低的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性。這一結果與我國長江中下游流域克氏原螯蝦群體遺傳多樣性的研究結果不一致[29-30]，說明洞庭湖區養殖克氏原螯蝦的種質來源比較單一。此外，根據Cytb基因序列得到的遺傳多樣性水平高于根據COⅠ基因序列得到的遺傳多樣性水平。這一現象的出現可能是因為Cytb基因相較于COⅠ基因變異速率快，這與其他的研究結果較為一致[31-32]。

在本研究中，單倍型系統進化樹和遺傳距離的結果均表明，洞庭湖區11個采集點克氏原螯蝦群體的遺傳分化并不顯著，其共有單倍型數量較多，存在一定的基因交流。11個采集點克氏原螯蝦的遺傳結構不同表現在兩個方面：(1)單倍型數量不同?；贑ytb基因序列的單倍型南縣(5個采集點)有3個，華容縣(6個采集點)有4個。基于COⅠ基因序列的單倍型南縣(5個采集點)有5個，華容縣(6個采集點)有6個；(2)優勢單倍型占比差異較大?；贑ytb基因序列的優勢單倍型為62.2%，基于COⅠ基因序列的優勢單倍型為86.1%，這種差異導致洞庭湖區養殖克氏原螯蝦遺傳多樣性不豐富。

遺傳多樣性越豐富，物種對環境的適應能力就越強，而遺傳多樣性降低對物種的生存極有可能造成不良的影響，甚至使其走向滅亡[33-35]。外來物種在入侵的過程中常常會經歷遺傳漂變或“瓶頸”效應，表現為遺傳多樣性偏低[36]。對于克氏原螯蝦這類外來物種，可以考慮其來源地和引入地，通過多次引種或雜交，提高其遺傳多樣性。