氧化石墨烯改性丙烯酸酯類軟襯材料的抗真菌活性體外分析

伍韓雪，儲順禮，蘇屹坤，朱炳震，盧倩倩，王景云

（吉林大學口腔醫學院VIP綜合科，長春 130021）

國內外關于氧化石墨烯（graphene oxide，GO）生物性的研究眾多，其中不乏抗菌活性的探討[1-3]，這些研究成果或將為GO成為新一代納米抗菌劑提供更多有力的理論支撐[4]。目前，有報道[5]氧化石墨烯作為抗菌劑加入到義齒基托樹脂中，但將GO加入到丙烯酸軟襯材料中作為抗菌劑的相關研究較少。本研究將不同質量分數的GO添加到丙烯酸酯類自凝軟襯材料中，并以白色念珠菌為菌種，探討添加不同質量分數GO軟襯材料的體外抗菌作用，為臨床丙烯酸酯軟襯材料抗菌活性的選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

自凝軟襯墊材料（天馳生物科技有限公司）；單層氧化石墨烯（單層片0.2～10 um，厚度1 nm，純度99.9%）（深圳市宏達昌進化科技有限公司）；白色念珠菌（Candidaalbicans，ATCC10231，上海魯微科技有限公司）；沙氏葡萄糖液體（肉湯）培養基（SDB）（杭州微生物）；沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）（杭州微生物）；場發射掃描電子顯微鏡；晶屏系列超聲波處理器 fs-100t（上海生析超聲儀器有限公司）；kq-100da 型數控超聲波清洗器（云南省昆山市超聲儀器有限公司）；冷熱循環儀（MX15R，PolyScience，美國威爾公司）；真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；分析天平（METTLER TOLEDO 公司）；L929細胞（CTCC），DMEM培養基 （Hyclone），FBS（Hyclone），青鏈雙抗（上海生工），細胞培養箱（Thermo），熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS，IX71），超凈工作臺（蘇州安泰科技有限公司），離心機（德國Eppendorf公司），CCK-8 （碧云天）， 酶標檢測儀（Thermo MK3型），傅里葉變換紅外光譜儀（美國賽默飛Nicolet iS5）。

1.2 含不同質量分數氧化石墨烯軟襯材料的制備

取適量的GO，按GO/軟襯材料的質量比（0.00 wt %，0.25 wt %，0.50 wt %，1.00 wt %，2.00 wt %）添加到去離子水中，用電動攪拌棒攪拌10 min，得到分布均勻的懸浮液體系；然后使用功率為150 W，頻率為20 kHz的超聲波分散儀繼續分散30 min后過濾。將得到的濾渣放到溫度為60 ℃，真空度為0.08 MPa的真空干燥箱中干燥24 h，得到分散性較好的填料粉末，然后將不同質量分數的GO加入軟襯C液中超聲分散20 min，使GO在液體中分散均勻；將粉（g）:液（mL）＝2:1均勻混合，加入到預先定制好的模具中制備出規格10 mm×10 mm×2 mm（±0.2 mm）的樣品每組9個，共45個。為排出所有因素的影響，材料準備初期，需將所有樣品經蒸餾水洗去附著物，再經超聲振蕩清洗20 min，最后經紫外線正反面分別照射30 min進行滅菌。

1.3 實驗樣品表征檢測

采用掃描電鏡（SEM）對實驗樣品進行表征檢測，具體取樣方式為每組隨機取出1個樣品進行噴金標記。并通過傅里葉變換紅外光譜儀對樣品材料的官能團進行檢測。

1.4 細胞毒性檢測

1.4.1 樣品浸提液的制備 各組樣品浸泡于75%酒精并同時紫外線照射1 h進行消毒，根據GB/T16886.5-2017標準，按培養基體積與試件表面積1 mL:1.25 cm2的比例制成所需液體，每一組分別取3個樣品，移入24 mL含有10% FBS的DMEM培養液中37 ℃條件下進行培養，并經過5% CO2培養箱中浸提24 h，最后經過細菌濾器過濾，最終獲得不同組別樣品的浸提液。分為空白對照組（單純細胞培養基，無細胞）；陰性對照組（細胞培養基接種細胞）；分別添加0.25 wt %、0.50 wt%、1.00 wt%、2.00 wt% GO的軟襯材料樣品浸提液為實驗組。

1.4.2 細胞株接種與細胞株培養 取凍存的L929細胞，37 ℃快速解凍后，1 200 r·min-1離心5 min，用DMEM培養基清洗 1～2次（因為在冷凍的過程中加入了對細胞繁殖生長有害的物質），用DMEM基礎培養基重懸后再離心，加入完全培養基進行培養，每天換一次培養基，觀察細胞生長狀況，長滿后備用。待細胞長滿后調整細胞濃度為5×104cells·mL-1，分別接種于96孔培養板中，96孔板每孔200 μL，在37℃，5% CO2于培養箱內培養24 h、48 h、72 h后備用，待各組細胞培養至相應時間點后，進行CCK8檢測。

1.4.3 CCK-8檢測 換培養液后分別于24 h、48 h、72 h末各取1個培養板，吸棄原培養基，PBS洗滌2次后，按照CCK-8試劑盒操作說明，向每孔中加入20 uL CCK-8，37℃，5% CO2培養箱內培養避光孵育3 h。酶標儀450 nm波長測出同一時間點OD 值，用測得的OD值進行細胞生長影響的分析。以上實驗重復3次。

1.4.4 細胞死活染色 將材料浸提液與細胞共培養至72 h后進行死活染色，取出鈣黃綠素-AM（Calcein AM solution）和碘化丙啶（PI solution），室溫平衡30 min，在10 mL的PBS中加入5 μL的PI solution和5 μL的Calcein AM solution，渦旋振蕩混勻制成工作液，此時Calcein AM solution的濃度為2 μm，PI的濃度為8 μm，按照實驗要求處理細胞后，用PBS溫和洗滌細胞3次，加入足量的染色工作液，保證沒過材料，37℃孵育30 min，熒光倒置顯微鏡拍照觀察。

1.5 抗菌性能檢測

1.5.1 實驗菌液制備 在無菌環境下，將凍干的白色念珠菌凍干菌加入到沙氏培養液中，輕吹幾次，使白色念珠菌均勻的分散在培養液中。取2 mL菌懸液接種于沙氏培養液中，于37℃下培養24 h后用移取100 μL培養菌懸液接種在沙氏培瓊脂培養基上，上述條件下繼續培養24 h。麥氏比濁法將傳代的白色念珠菌制備成濃度為1×107CUF·mL-1的菌懸液，備用。

1.5.2 抗菌率檢測 采用貼膜法對含不同質量分數GO的軟襯材料抗菌性能進行測試。從每組濃度中取3個樣品，分別置于15個滅菌板中，然后均加入200 μL白色念珠菌實驗菌懸液，用聚丙烯薄膜覆蓋，使菌液與樣品均勻接觸。于37℃培養箱24 h，取出后將20 mL無菌生理鹽水加入每組實驗樣品中，在超聲振蕩器上劇烈振蕩1 min，將器皿中的樣品和聚丙烯薄膜清洗徹底，使得洗脫液混合均勻， 然后將其等比例10倍稀釋至1×10-2CUF·mL-1。每濃度取100 μL接種于SDA培養基上，在恒溫培養箱培養24～48 h，測量細菌的數量，實驗重復3次，取平均值。

注：R為抗菌率（%）；A為對照樣品回收的平均菌數（CFU /片）；B為抗菌樣品回收的平均菌數（CFU /片）；抗菌率r≥99%的抗菌樹脂為有較強的抗菌效果

1.6 抗菌持久性的檢測

1.6.1 樣品的制備與分組 根據抗菌性能的檢測結果發現，當軟村材料中GO含量為2.00 wt%時，其抗菌率最高，可達99%，因此選擇GO添加量為2.00 wt%的軟襯材料，樣品的制備方法與材料和方法1.2相同。

1.6.2 菌液的配置 菌液的配置方法同1.5.1。

1.6.3 軟襯材料體外老化處理 分為5組，每組6個。1）空白對照一組：未添加GO的軟襯材料經過紫外線燈照射8 h；2）空白對照二組：在5～55 ℃的條件下冷熱循環5 000次老化處理；3）新制備組：未經任何處理的抗菌試件；4）實驗一組：紫外線燈照射8 h；5）實驗二組：5～55 ℃的條件下冷熱循環5 000次。

1.6.4 抗菌率測定 抗菌率檢測同1.5.2。

1.7 統計學方法

采用SPSS 24.0軟件進行統計分析，數據采用正態分布和方差齊性檢驗兩種方法進行分析。

2 結果

2.1 樣品表征

2.1.1 樣品表面形貌 用SEM觀察不同組樣品的表面形貌，見圖1。

圖1 添加不同質量分數GO的軟襯材料表面形貌觀察（×5000）

2.1.2 傅里葉變換紅外光譜分析 由紅外光譜分析可知，5個樣品在軟襯材料和GO官能團如- CH2（2 958 cm-1）、C= O（1 719 cm-1）、C-H（1 449 cm-1）、C-O-C（1 179cm-1）和 C-O（1 072 cm-1）處均有特征峰，各組波形未見明顯差異（P＞ 0.05）（見圖2）。

圖2 氧化石墨烯改性丙烯酸酯類軟襯材料5個樣品的紅外光譜對比圖

2.2 體外細胞毒性

2.2.1 CCK-8檢測結果 含有不同質量分數GO的義齒軟襯材料體外細胞毒性（見圖3），在相同的時間處理里，5種材料浸提液對于細胞增殖均無抑制效果。

圖3 不同時間點稀釋物質提取物對細胞增殖的影響

2.2.2 活死細胞染色結果 通過熒光顯微鏡觀察，各組的L929細胞存活率均在98%以上（見圖4），各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 軟襯材料的體外細胞毒性

2.3 樣品的抗菌性檢測

2.3.1 菌落數計量和抗菌率檢測 通過對比各組樣品白色念珠菌的抗菌效果涂片，可以明顯的發現對照組中菌落最多且密集，而各實驗組菌落相對較少且稀疏（見圖5）。統計結果表明，各實驗組白色念珠菌的菌落數均呈現顯著降低（P＜0.01）。1.00 wt%組對白色念珠菌的抗菌率為93.04%，具有抗菌作用；2.00 wt%組對白色念珠菌的抗菌率為99.41%，具有強抗菌作用（見表1）。

圖5 各組樣品對口腔白色念珠菌的抗菌效果

表1 各組樣品對白色念珠菌的抗菌率（±s）

表1 各組樣品對白色念珠菌的抗菌率（±s）

注：與對照組比較，## P＜0.01

組別 GO添加量/wt% 菌落數/105 CFU·mL-1 抗菌率/%對照組 0.00 460.001.65 —實驗一組 0.25 136.004.32 70.43##實驗二組 0.50 65.004.32 85.87##實驗三組 1.00 32.005.89 93.04##實驗四組 2.00 2.671.70 99.41##

2.3.2 老化后菌落數計量和抗菌率檢測 見表2。

表2 加入2wt%GO的義齒軟襯材料經老化處理后對白色念珠菌作用（±s，n= 6）

表2 加入2wt%GO的義齒軟襯材料經老化處理后對白色念珠菌作用（±s，n= 6）

注：與新制備組比較，# P＜0.05

組別 菌落數/105 CFU·mL-1 抗菌率/%空白一組 46.002.65 -空白二組 43.001.29 -新制備組 3.001.63 93.48實驗一組 11.001.83 76.09#實驗二組 6.001.29 86.96#

3 討論

石墨烯由于其獨特的物理化學性質，在超級電容器、鋰離子電池、太陽能電池、電化學傳感器、氣體傳感器、透明導電電極、場發射裝置、電子器件、光催化、能源相關領域和聚合物基納米復合材料等各個研究領域得到了廣泛的研究[6]。GO具有各種反應官能團，環氧和酚羥基位于其基面上，羧基位于其邊緣[7]。因此，GO納米片在水中具有良好的化學穩定性和分散能力[8]，從而更易于與聚合物制備成復合材料。初步研究發現，石墨烯基納米材料對革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌[9]甚至包括真菌病原體[10]均能產生毒性作用，抑制其生長。GO具有邊緣切割效應，細胞包埋能力和氧化應激反應等多重抗菌機制，其抗菌能力相較于石墨烯得到了有效提升[11]，因此其被認為是目前最有效的新興納米抗菌材料[4]。

圖6 各組樣品對口腔白色念珠菌的長期抗菌效果

本實驗采用貼膜法將實驗菌液直接涂抹在軟襯材料表面，模擬臨床中菌斑在軟襯材料表面的沉積的過程。抑菌實驗結果顯示，各實驗組對白色念珠菌均抑菌作用，且隨軟襯材料中GO含量的增加，抑菌效果增強。Lee等[12]研究發現，樹脂基質添加GO可對白色念珠菌的生長和粘附起到明顯的抑制作用。本實驗中，1 wt%組可稱為“有抗菌作用”，2 wt%組可稱為“有強抗菌作用”，實驗還采用加速老化處理的方法研究了其抗菌效果的持久性。結果表明，經過加速老化處理后，2 wt%GO組相較于未經處理的組的抗菌性能略有下降，但仍有較好的抗菌效果。

實驗結果表明，當丙烯酸酯義齒軟襯材料中GO含量為2 wt%時，對白色念珠菌抗菌效果最好，這對抗菌義齒進一步的研究和開發提供了重要的理論依據。相信隨著技術的進步和理論的不斷完善，GO義齒軟襯材料終將有望應用于臨床，成為一種新型抗菌義齒軟襯材料。本實驗中，隨著GO含量的增加，軟襯材料的顏色逐漸加深，固化時間延長，黏性變大。本實驗的不足之處，只探討了GO對浮游態白色念珠菌的抗菌效果，未對生物膜狀態下的抗菌率進行探討。今后的研究方向將在GO義齒軟襯材料顏色的改善、抗菌機理和生物安全性方面展開，為GO義齒軟襯材料早日應用于臨床做好充分的準備。