過表達TBX2對膠質瘤細胞增殖和侵襲的影響

劉小江 管 誠 李 軍 管義祥

膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤，病死率呈逐年增加趨勢[1，2]。盡管在過去的幾十年中，膠質瘤的診治取得了重大進展，但其臨床結局仍然不理想，中位生存期約為14個月[3]。目前，膠質瘤的標準治療方法是手術輔助替莫唑胺治療和放療[4]，但是5年總生存率不超過35%[5]。因此，研究者開始逐步開發分子靶向療法、免疫療法、基因療法和新型藥物遞送技術。相比于其他腫瘤，目前仍缺乏對膠質瘤診療的有效分子靶標[6，7]。因此，探討膠質瘤腫瘤診斷和治療的分子靶標和其分子機制具有重要意義。

TBX2 是保守化轉錄因子T-box 家族的成員之一[8，9]。研究發現TBX2在多種惡性腫瘤中呈高表達，在腫瘤演變的過程中發揮作用[10～13]。本文探討TBX2在膠質瘤中的表達，及其過表達對膠質瘤細胞惡性生物學行為的影響，從而為膠質瘤的診治、預后評估等提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織標本來源 收集2017 年7 月～2019 年6 月手術切除并經術后病理證實的膠質瘤樣本以及對應的瘤旁組織（術前靜脈注射熒光素鈉，術中使用熒光顯微鏡觀察腫瘤的顏色跟質地以判斷腫瘤的邊界，距腫瘤組織1 cm 以上認為是瘤旁組織）各53 例，其中男30 例，女23 例；年齡35～71 歲。WHO 分1～2 級24例，3～4 級29 例。所有病人術前均未行放療或化療。本研究已經我院倫理委員會審核通過。

1.2 細胞培養 膠質瘤細胞U251、U87、SHG-44（中國科學院細胞庫）使用含10%胎牛血清（美國Invitrogen公司）的DMEM（美國Invitrogen 公司）培養，人正常星型膠質細胞（HA1800；中國科學院細胞庫）使用RPMI 1640（美國Invitrogen 公司）培養，待細胞融合達到80%～90%時，進行傳代以備后續實驗使用。

1.3 細胞轉染 構建過表達TBX2（TBX2-OE）及干擾TBX2（TBX2-sh）質粒，分別用空載體（negative control，NC）-OE 和NC-sh 作為對照。取對數生長期U251細胞，用LipofectamineTM 2000試劑盒（美國Invitrogen公司）進行轉染，48 h后檢測轉染效率。

1.4 實時熒光定量PCR 檢測mRAN 使用Trizol 試劑（上海通蔚生物有限公司）提取組織以及細胞總mRNA，嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書（上海雙贏生物科技有限公司）將mRNA 逆轉錄成cDNA。使用SYBR Green 熒光試劑盒（上海雙贏生物科技有限公司）擴增目的基因，采用2-ΔΔCt法量化，以GAPDH為內參。引物序列：TBX2 正義鏈5′-CACTCGCTTGACCGAACCC-3′，反義鏈5′-CGCACTGTCTGTCTGCACCA- 3′；GAPDH 正 義 鏈5′- CTGCCCAGAACATCATCCCT-3′，反 義 鏈5′-TGAAGTCGCAGGAGACAACC-3′。

1.5 免疫印跡法檢測蛋白表達 使用預冷磷酸鹽緩沖液洗滌組織及細胞3 次，用RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 g 離心20 min 留取上層蛋白清液。使用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳分離后，轉移至PVDF 膜。使用封閉液室溫封閉1 h。4 ℃條件下與一抗（上海碧云天生物技術有限公司）孵育過夜，用TBST洗滌PVDF膜3次，加入對應二抗（上海碧云天生物技術有限公司）在室溫下孵育1 h。使用ECL發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）顯像。β-actin用作內參，用Image J測定蛋白條帶灰度。

1.6 細胞增殖的測定及細胞生長曲線的繪制 將穩定轉染的U251細胞以1×104個/孔接種于96孔板，根據試劑盒說明，0、24、48、72、96和120 h進行WST-1分析（上海碧云天生物技術有限公司）。棄除培養基后使用PBS 沖洗細胞3 次，向各孔中加入含10 μL WST-1 及90 μl 正常培養基溶液的混合培養液，37 ℃孵育30 min，使用酶標儀測定450 nm 處吸光度，并繪制細胞生長曲線。

1.7 細胞侵襲的測定 將穩定轉染的U251細胞以1×105個/孔接種于涂有基質膠的Transwell 聚碳酸酯濾膜上，加入200 μl無血清的培養基；下層小室加入含10%胎牛血清的正常培養基，將細胞放回培養箱繼續培養48 h。在室溫下，依次用3.7%甲醛固定細胞15 min，用含有0.1%結晶紫10%乙醇溶液染色30 min。除去多余染液，在光學顯微鏡下觀察，400 倍視野下計數侵襲細胞數。

1.8 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件分析；定量資料以±s表示，采用t檢驗和單因素方差分析；以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膠質瘤組織TBX2 表達變化 相比于瘤旁組織，膠質瘤組織TBX2 mRNA 和蛋白表達水平均明顯增加（P＜0.05）；并且，高級別膠質瘤組織TBX2 mRNA和蛋白水平均顯著高于低級別膠質瘤（P＜0.05）。見圖1。

圖1 膠質瘤組織TBX2 mRNA和蛋白表達水平

2.2 膠質瘤細胞系TBX2的表達變化 相比于人正常星型膠質細胞系HA1800，膠質瘤細胞系U251、U87、SHG-44細胞TBX2 mRNA和蛋白表達水平均明顯增高（P＜0.05）。此外，U251 細胞TBX2 表達水平顯著高于U87 和SHG-44 細胞（P＜0.05），因此使用U251細胞進行后續實驗。

2.3 細胞轉染質粒的有效性驗證 相比于NC-OE組，TBX2-OE 組U251 細胞TBX2 mRNA 和蛋白表達水平均顯著增加（P＜0.05）。與NC-sh組比較，TBX2-sh組U251細胞TBX2 mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。

圖2 膠質瘤細胞系TBX2 mRNA和蛋白表達水平

2.4 TBX2 表達水平與膠質瘤U251 細胞增殖及侵襲的關系 過表達TBX2 顯著增加U251 細胞增殖和侵襲能力（P＜0.05）；低表達TBX2 顯著抑制U251 細胞增殖和侵襲能力（P＜0.05）。見圖3

圖3 細胞轉染質粒的有效性驗證

3 討論

圖4 TBX2表達與膠質瘤U251細胞增殖和侵襲的關系

本文結果顯示膠質瘤組織TBX2 的表達水平顯著增加，尤其是高級別膠質瘤。這提示TBX2可能與膠質瘤的發生發展相關。Pan 等[14]發現膠質母細胞瘤TBX2表達上調，明顯降低E-鈣粘蛋白的表達、增加波形蛋白的表達，增強細胞侵襲能力。本文結果顯示TBX2 過表達明顯促進膠質瘤細胞增殖及侵襲。目前，TBX2發揮促腫瘤作用的信號通路尚不清楚。Liu等[15]發現TBX2可通過ERK信號通路增強胃癌細胞的上皮間充質轉化和侵襲能力。另外，TGFβ1信號通路可能與TBX2促進腫瘤細胞增殖和遷移有關[16]。

總之，膠質瘤TBX2 表達上調，過表達TBX2 可顯著增強膠質瘤細胞的增殖、侵襲能力。