地中海貧血篩查及其聯(lián)合試驗(yàn)的診斷價(jià)值評(píng)價(jià)*

謝彩蓮，陳明發(fā)

南平市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，福建南平 353000

地中海貧血屬于臨床常見(jiàn)的遺傳性溶血性貧血疾病之一，病理機(jī)制為遺傳基因缺陷造成體內(nèi)血紅蛋白中珠蛋白鏈無(wú)法合成，造成血紅蛋白合成比例失衡，從而導(dǎo)致患者出現(xiàn)貧血狀態(tài)［1］。地中海貧血目前尚無(wú)有效的根治方法，重型α-地中海貧血胎兒大多數(shù)在出生時(shí)死亡，而重型β-地中海貧血患者只能依靠定期輸血、除鐵治療和造血干細(xì)胞移植生存［2］，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)，有效預(yù)防和控制重型地中海貧血患兒的出生是當(dāng)前衛(wèi)生部門(mén)的首要任務(wù)。因此篩查育齡婦女夫妻雙方地中海貧血攜帶者是孕前的必要項(xiàng)目，對(duì)同型攜帶者今后孕期的產(chǎn)前診斷尤為重要。分子生物學(xué)技術(shù)是篩查地中海貧血的可靠手段，但受限于設(shè)備，技術(shù)，人員，機(jī)構(gòu)要求高且價(jià)格昂貴，不適合做常規(guī)的篩查方法。血常規(guī)的平均紅細(xì)胞血紅蛋白量（MCH）平均紅細(xì)胞體積（MCV）是評(píng)價(jià)貧血的重要指標(biāo)，毛細(xì)管電泳法檢測(cè)血紅蛋白（HbA2）含量的異常對(duì)地貧篩查有重要的作用［3］，本研究旨在研究單獨(dú)檢測(cè)或者聯(lián)合檢測(cè)在地貧診斷的價(jià)值，及各指標(biāo)對(duì)基因分型的敏感性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取南平市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心婚檢科1 929例受檢者，對(duì)其進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)MCH和（或）MCV，若水平低于參考值，任一方有異常，進(jìn)行血紅蛋白毛細(xì)管電泳檢測(cè)，出現(xiàn)HbA2值異常和（或）HbF異常和（或）出現(xiàn)異常血紅蛋白條帶，進(jìn)而地貧基因檢測(cè)，共536例受試者，年齡范圍20～50歲，男女各268例，夫婦雙方知情同意本實(shí)驗(yàn)流程，排除重大傳染病及惡性病患者。

1.2 儀器和試劑

全自動(dòng)血細(xì)胞自動(dòng)分析儀分析MCV和MCH，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為MCV＜82.0 fL、MCH＜27.0 pg，sebia MINICAP全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行血紅蛋白電泳，檢測(cè)HbA2含量，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為HbA2＜2.5和（或）＞3.5，基因檢測(cè)樣本DNA提取采用亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司生產(chǎn)的人體血細(xì)胞DNA抽提試劑盒，提取的DNA采用跨越斷裂點(diǎn)PCR（Gap-PCR）和多重PCR結(jié)合擴(kuò)增α、β地貧基因，通過(guò)全自動(dòng)核酸雜交儀進(jìn)行雜交反應(yīng)，同時(shí)進(jìn)行3種α地貧缺失檢測(cè)（--SEA、-α3.7、-α4.2）、3種α地貧突變檢測(cè)（ααQS、ααCS、ααWS）和17種β地貧突變檢測(cè)（βIVS-II-654、βCD41-42、βCD17、βCD28、βCD29、βCD30、βCD32、βCD14-15、βE、βCD27-28、βCD31、βCD43、βCD71-72、βIVS-Ⅰ-1M、βIVS-Ⅰ-5M、βCAP、βInt）。

1.3 方法

以地貧基因篩查為金標(biāo)準(zhǔn)，分析地貧組與非地貧組在MCH、MCV、HbA2水平上的差異。單獨(dú)比較血細(xì)胞分析的MCH、MCV任一方有異常和毛細(xì)管電泳HbA2異常與基因結(jié)果比對(duì)結(jié)果及兩種檢測(cè)方法的聯(lián)合篩查與基因結(jié)果的比對(duì)，它們?cè)陟`敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、符合度上的差異。3個(gè)篩查指標(biāo)分別在地貧基因分型上的檢出率和漏診率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。服從正態(tài)分布的指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)算血紅蛋白電泳篩查、血細(xì)胞分析篩查及其聯(lián)合篩查的靈敏度、特異性、預(yù)測(cè)值，檢出率和漏診率以例數(shù)和百分比（%）表示。組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 地中海貧血篩查結(jié)果

總篩查結(jié)果符合率為53.4%，篩查陽(yáng)性結(jié)果符合率為56.2%。電泳異常符合率為55.6%，HbA2＞3.5異常值符合率為98.1%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于HbA2＜2.5符合率的41.5%。MCH、MCV單項(xiàng)異常和MCH和（或）MCV異常符合率相近，為78.9%、76.3%、75.4%，篩查陰性結(jié)果符率為96.6%，見(jiàn)表1。

表1 地中海貧血篩查結(jié)果

2.2 地中海貧血基因檢測(cè)結(jié)果

536例病例中確診為地中海貧血攜帶者286例，α地貧179例，占62.7%，以--SEA/αα占多數(shù)；β地貧98例，占34.3%，以βIVS-II-654/βN占多數(shù)；α+β復(fù)合地貧9例，占3.1%，基因檢測(cè)結(jié)果型別，見(jiàn)表2。

表2 地中海貧血基因檢測(cè)結(jié)果

2.3 地貧篩查指標(biāo)在地貧組和非地貧組的變化

536例病例地貧組MCV、MCH水平明顯低于非地貧組，HbA2水平高于非地貧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；α地貧的MCH、MCV水平低于非地貧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HbA2水平差異無(wú)意義（P＞0.05）；β地貧的MCH、MCV水平低于非地貧組，HbA2水平高于非地貧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 地貧篩查指標(biāo)在地貧組和非地貧組的變化（±s）

表3 地貧篩查指標(biāo)在地貧組和非地貧組的變化（±s）

a表示與非地貧組比較，P＜0.05。

組別地貧組αβ非地貧組HbA2（%）3.40±1.526a 2.33±0.480 5.25±0.735a 2.34±0.445 MCV（fL）70.36±6.929a 72.47±6.618a 66.73±5.863a 85.93±9.585 MCH（pg）22.34±2.685a 22.96±2.669a 21.27±2.363a 28.58±6.491

2.4 篩查實(shí)驗(yàn)的診斷效能

2.4.1 兩種篩查方法在靈敏度和特異度上的差異根據(jù)篩查方法分為血細(xì)胞分析法和血紅蛋白毛細(xì)管電泳法，經(jīng)地貧基因確診的536例患者中286例為地中海貧血攜帶者，250例為非地貧攜帶者，血細(xì)胞分析法在靈敏度上和特異度上都高于毛細(xì)管電泳法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4、表5。

表5 兩種地貧篩查方法特異度情況

2.4.2 不同篩查策略的診斷價(jià)值評(píng)價(jià)根據(jù)不同的篩查策略分為血細(xì)胞分析結(jié)果與基因結(jié)果比對(duì)、毛細(xì)管電泳結(jié)果與基因結(jié)果比對(duì)、細(xì)胞分析結(jié)果及電泳均異常與基因比對(duì)以及細(xì)胞分析和（或）電泳結(jié)果（任一陽(yáng)性）異常與基因結(jié)果比對(duì)得知，單獨(dú)血細(xì)胞分析策略在靈敏度、符合度上最高，單獨(dú)毛細(xì)管電泳和細(xì)胞分析和（或）電泳結(jié)果（任一陽(yáng)性）異常兩種策略在特異度、符合度上都相對(duì)較低，細(xì)胞分析結(jié)果及電泳均異常在靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值的綜合評(píng)估最佳，見(jiàn)表6～表9。

表6 血細(xì)胞分析結(jié)果與基因結(jié)果

表7 毛細(xì)血管電泳結(jié)果與基因結(jié)果

表8 細(xì)胞分析結(jié)果及電泳均異常與基因結(jié)果

表9 細(xì)胞分析和（或）電泳結(jié)果（任一陽(yáng)性）異常與基因結(jié)果

2.5 篩查指標(biāo)在地貧分型上的診斷意義

286例地中海貧血攜帶者中，α地貧179例，β地貧及復(fù)合型地貧107例。MCH在α地貧和β地貧及復(fù)合型地貧檢出率為92.7%、98.1%，漏診率為8.4%、1.9%、MCV在α地貧和β地貧及復(fù)合型地貧檢出率為82.1%、96.3%，漏診率為19.0%、3.7%，兩指標(biāo)在地貧兩個(gè)型別上都有較高的檢出率和較低的漏診率；HbA2在α地貧和β地貧及復(fù)合型的檢出率為76.5%、95.3%，α地貧的檢出率明顯小于β地貧及復(fù)合型的檢出率；聯(lián)合篩查在α地貧檢出率和漏診率為64.2%、36.9%，在β地貧及復(fù)合型檢出率和漏診率為92.5%、7.5%，也在β地貧及復(fù)合型里顯示更大的優(yōu)勢(shì)，見(jiàn)表10。

表10 篩查各指標(biāo)在地貧基因分型的檢出情況和漏診情況例（%）

3 討論

地中海貧血是一種以編碼的血紅蛋白基因點(diǎn)突變或基因片段的缺失導(dǎo)致代償性紅細(xì)胞增多，致使高鐵血紅蛋白血癥及溶血性貧血，影響患者生活質(zhì)量［4］，以肝脾腫大、黃疸等為主要臨床表現(xiàn)，病情嚴(yán)重甚至可導(dǎo)致患者死亡的遺傳性疾病，因此，地中海貧血已成為國(guó)內(nèi)高度關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題［5］，目前臨床上針對(duì)地中海貧血仍以預(yù)防為主，即通過(guò)全面普及地中海知識(shí)，通過(guò)婚前檢查與產(chǎn)前篩查等方式預(yù)防地中海貧血患兒出生，避免地中海貧血在家族中遺傳。本研究選取南平地區(qū)1 929例婚檢者為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)MCV、MCH兩貧血指標(biāo)和血紅蛋白電泳的HbA2含量的檢測(cè)，以地貧基因?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)［6］，探討地中海篩查試驗(yàn)的診斷價(jià)值。

本研究對(duì)地貧基因檢測(cè)結(jié)果顯示，α地貧攜帶者居多，占62.7%，--SEA/αα為主要突變類型，其結(jié)果與其他地區(qū)報(bào)道相似［7］。β地貧以βIVS-II-654/βN為主要突變類型，與付月等［7］報(bào)道的CD17、CD41-42、IVS-II-654，分別占44.04%、25.39%、21.76%有差異，及相關(guān)報(bào)道主要β地中海貧血基因型為CD41-42/N、CD17/N和CD-28/N不一致［8］，這說(shuō)明地中海貧血的基因突變頻率可能與地方氣候，環(huán)境及人口遷徙因素等有關(guān)系或者本研究樣本量不夠多，導(dǎo)致其他突變類型沒(méi)有完全顯現(xiàn)，針對(duì)這些常見(jiàn)基因突變類型對(duì)婚前、孕前篩查以及產(chǎn)前基因診斷可以有效降低地中海貧血患兒的出生率。

通過(guò)基因確診兩種地貧篩查試驗(yàn)總符合率并不高，為56.2%，其中MCV降低、MCH降低、MCV和（或）MCH降低三者符合率分別為78.9%、76.3%、75.4%，主要原因?yàn)樾〖?xì)胞低色素貧血，例如缺鐵性貧血、鐵粒幼細(xì)胞性貧血及其他溶貧都可表現(xiàn)為MCH、MCV降低，增加了假陽(yáng)性，因此初篩為地貧的患者需經(jīng)過(guò)血清鐵蛋白檢測(cè)，從而加以診斷鑒別［9］。HbA2＞3.5疑是β地貧的符合率高達(dá)98.1%，而HbA2＜2.5疑是α地貧的符合率僅為41.5%，大大降低了血紅蛋白的整體符合率，說(shuō)明HbA2在地貧分型上對(duì)β-地貧有更大的診斷意義。所以從單一指標(biāo)去診斷地中海貧血存在局限性，應(yīng)當(dāng)對(duì)幾個(gè)篩查指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合篩查，以提高地中海貧血診斷的準(zhǔn)確性。

根據(jù)地貧基因診斷結(jié)果分為地貧組和非地貧組，研究發(fā)現(xiàn)地貧組的MCV、MCH水平明顯低于非地貧組，HbA2水平高于非地貧組，說(shuō)明地貧患者的三個(gè)指標(biāo)有異于正常人可以作為疑是地貧的判斷標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)將地貧組分為α地貧和β地貧，分別與非地貧組做比較，發(fā)現(xiàn)β地貧HbA2水平明顯高于非地貧組，α地貧HbA2水平與非地貧組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與孫艷虹等［10］的研究發(fā)現(xiàn)一致，由于其他疾病如缺鐵性貧血也可以表現(xiàn)出HbA2水平的降低，所以該指標(biāo)在α地貧的特異性不高，與非地貧組結(jié)果無(wú)明顯差異。綜上所述，可以在疑是地貧的判斷下，根據(jù)血紅蛋白電泳HbA2水平區(qū)分α地貧和β地貧，再進(jìn)行地貧基因確診。

本研究中對(duì)比血細(xì)胞分析法和血紅蛋白毛細(xì)管電泳法在靈敏度和特異度上存在差異，故將兩種方法做單獨(dú)和聯(lián)合篩查與基因結(jié)果對(duì)比，比較實(shí)驗(yàn)效能上差異的不同策略。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血細(xì)胞分析結(jié)果與基因結(jié)果比對(duì)和血細(xì)胞分析和（或）電泳結(jié)果（任一陽(yáng)性）異常與基因結(jié)果比對(duì)在靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值在四種策略中最佳，在表9中兩種篩查方法任一均為陰性的2例患者確診為靜止型α地貧，當(dāng)患者為輕型或靜止型α地貧時(shí)血象和HbA2都無(wú)法表現(xiàn)出來(lái)［11］，臨床上這部分的地貧患者有可能被漏診，需要基因診斷確診，臨床上需要排除健康人群的為目的可選用這種漏診率最低的篩查方法，有效降低假陰性率。但由于缺鐵性貧血等其他溶血性貧血也可能表現(xiàn)在MCV、MCH上降低，所以此方法在特異性不高，需要結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)加以鑒別貧血類型。毛細(xì)管電泳結(jié)果與基因結(jié)果比對(duì)在特異度上較差即假陽(yáng)性率較高，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)得知所測(cè)HbA2值較多集中在2.4～2.5，Hb測(cè)定受到標(biāo)本保存運(yùn)輸、檢測(cè)時(shí)間、操作水平多種因素的影響，各地區(qū)可以根據(jù)當(dāng)?shù)氐那闆r以及實(shí)驗(yàn)室狀態(tài)建立自身的篩查截?cái)嘀担?2］，減少非特異性因素，降低誤診率。特異性最高的篩查策略為細(xì)胞分析聯(lián)合毛細(xì)管電泳均異常與基因結(jié)果比對(duì)，此聯(lián)合篩查策略特異度為74.8%，可以有效排除非地貧患者人群，該篩查方法靈敏度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值及符合度在地貧診斷價(jià)值上的評(píng)估為最佳策略，與孫艷虹［10］等的研究相同，保證較低漏診率的同時(shí)，提高檢測(cè)陰性患者的能力，減輕了患者的經(jīng)濟(jì)損耗和心理負(fù)擔(dān)。

本研究結(jié)果表明，血細(xì)胞分析在分型上沒(méi)有特異性，指標(biāo)降低常見(jiàn)的還有缺鐵性貧血、慢性病貧血、環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞性貧血、鉛中毒等［8］，但地貧患者往往在這兩指標(biāo)上都顯示異常，MCH在α地貧和β地貧及復(fù)合型地貧檢出率為92.7%和98.1%、MCV在α地貧和β地貧及復(fù)合型地貧檢出率為82.1%和96.3%。HbA2在α地貧上的檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于β地貧及復(fù)合型地貧，且在β地貧及復(fù)合型地貧的漏診率較低，為4.7%。以HbA2＜2.5疑為α地貧、HbA2＞3.5疑為β地貧為陽(yáng)性截?cái)嘀担?3］，在表1中的符合率分別為41.5%和98.1%，所以HbA2在篩查β地貧更有診斷價(jià)值，該結(jié)論與何平亞等［14-16］的研究結(jié)果一致。三指標(biāo)聯(lián)合篩查在α地貧和β地貧及復(fù)合型地貧檢出率也有較大區(qū)別，但只是綜合了前兩者的特異性和非特異性，所以作為基因分型可以參照HbA2去初步判定β地貧，確診需要做地貧基因診斷。

綜上所述，地貧篩查試驗(yàn)在普查健康人群中有一定的診斷價(jià)值，通過(guò)聯(lián)合篩查診斷地中海貧血是最佳策略，參考血紅蛋白電泳HbA2在鑒別β地貧中更具有優(yōu)勢(shì)，最終通過(guò)地中海貧血基因診斷確診地貧攜帶者，防止重型胎兒的出生，減少出生缺陷的發(fā)生。