液氮凍融聯合胰蛋白酶消化脫細胞法構建豬心臟瓣膜支架的研究

崔勇 梅富楊 胡志斌 葛根賢 孫高忠

心臟瓣膜病是我國常見的成人心臟病，瓣膜置換手術是目前主要的治療方法。目前臨床上應用的人造心臟瓣膜主要有機械瓣和生物瓣兩大類，均能有效改善血流動力學，但又各有缺陷。機械瓣置換后患者需終身抗凝，因抗凝不當而造成的出血和血栓栓塞是影響患者長期存活的重要因素，而生物瓣置換后一般15年左右會發生衰敗，需要再次更換[1-2]。隨著生物技術的發展，組織工程心臟瓣膜（tissue engineered heart valve,TEHV）有望解決上述問題[3-4]。TEHV的研制涉及瓣膜支架的制備、種子細胞的選擇、細胞種植與體外預適應等過程。瓣膜支架的制備是TEHV研究的核心內容之一，理想的生物材料支架需具備生物相容性、抗鈣化及細胞親和性等條件[5-6]。脫細胞瓣膜是將同種異體或者異種心臟瓣膜作為TEHV的支架材料，具有瓣膜形態和結構完整、生物相容性好、利于內皮細胞黏附和生長等優點[7-8]。本研究通過液氮凍融聯合胰蛋白酶消化的方法，對豬心臟瓣膜進行脫細胞處理，期望獲得無免疫原性、結構完整、有抗鈣化潛能的去細胞瓣膜，為TEHV研制提供合適的支架材料。

1 材料和方法

1.1 材料和分組 成年豬（由浙江省桐鄉市濮院國聯商業有限公司屠宰場提供）宰殺后即刻（熱缺血時間10 min以內）在清潔條件下取出主動脈瓣膜，肉眼檢查瓣膜質量，留取外觀正常的瓣葉，無菌操作下剪成約1 cm×1 cm的小塊，經PBS沖洗后置入液氮罐中帶回實驗室處理。將豬心臟瓣膜小塊按隨機數字表法分為實驗組、對照組和未處理組，平均每組設置5個重復標本。

1.2 方法

1.2.1 豬心臟瓣膜標本的處理 將標本予5次液氮凍融，每次3 min；經PBS清洗后，實驗組標本浸入0.6%胰蛋白酶溶液，37℃搖床，消化3 d；再經PBS清洗后浸入5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS）（批號：A100227，上海生工生物工程股份有限公司）溶液中，40℃，3 d。對照組標本經液氮凍融后浸入5%SDS溶液中，37℃，6 d。未處理組通過液氮凍融后，浸入無菌0.9%氯化鈉溶液中，常溫，6 d。

1.2.2 瓣膜組織大體結構和細胞成分變化觀察 將3組豬心臟瓣膜組織標本浸入4%多聚甲醛溶液（批號：P0099，上海碧云天生物技術有限公司）中固定12 h，經石蠟包埋、組織切片和脫蠟，經HE（批號：C0105S，上海碧云天生物技術有限公司）染色后，用中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.2.3 瓣膜組織膠原纖維結構觀察 將上述脫蠟后的組織切片，經維多利亞藍（Victoria blue,VB）染液、麗春紅-苦味酸染液（批號：A600985，上海生工生物工程股份有限公司）染色后用中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4 瓣膜組織殘留DNA含量檢測 將脫細胞的豬心臟瓣膜標本真空抽干后，經液氮研磨成粉末，取20 mg，利用 DNA提取試劑盒（批號：9765，日本 TaKaRa公司）提取DNA，利用紫外分光光度計檢測殘留DNA含量。

1.2.5 瓣膜組織α-Gal抗原殘留檢測 采用Western blot法。將上述的組織粉末，按100 mg組織加入30 μl RIPA溶液（批號：P0013C，上海碧云天生物技術有限公司）提取組織蛋白，離心后經BCA試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，P0010C）測定蛋白濃度。以30 μg蛋白作為上樣量，經SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉后，加入 1∶1 000稀釋的 α-Gal一抗（批號：A01135-2，武漢博士德生物技術有限公司），4℃孵育過夜；再經1∶5 000稀釋的二抗室溫下孵育1 h；清洗后顯影。免疫印跡條帶的灰度值使用Image J軟件分析，并以上樣蛋白量為參照計算相對灰度值。

1.2.6 瓣膜組織抗鈣化潛能觀察 將脫蠟復水的組織切片，加入茜素紅染色液（批號：ST1078，上海碧云天生物技術有限公司）浸染5～10 min；蒸餾水充分洗滌；經常規水化透明后用中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件，符合正態分布的計量資料以 表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組豬心臟瓣膜組織大體結構和細胞成分比較實驗組瓣膜組織無明顯的細胞殘留[（3.8±1.3）%]，而對照組仍有少量細胞殘留[（17.8±3.7）%]，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.01）；未處理組可見大量的細胞殘留，見圖 1（插頁）。

圖1 3組豬心臟瓣膜組織大體結構和細胞成分比較（a：豬心臟瓣膜組織的大體結構，HE染色，×200；b：3組心臟瓣膜組織細胞殘留率比較，**P＜0.01）

2.2 3組豬心臟瓣膜組織膠原纖維結構觀察 實驗組膠原纖維結構完整，纖維束排列整齊，未見明顯破壞和斷裂；對照組膠原纖維也未受到明顯破壞，但組織略顯疏松，見圖2（插頁）。

圖2 3組豬心臟瓣膜組織膠原纖維結構觀察（麗春紅-苦味酸染色，×200）

2.3 3組豬心臟瓣膜組織殘留DNA含量比較 脫細胞處理后，實驗組瓣膜組織殘留DNA含量為（55.6±16.8）μg/g，對照組瓣膜組織殘留DNA含量為（750.4±178.1）μg/g，兩組瓣膜組織殘留DNA含量均顯著低于未處理組的（7 563.1±1 169.3）μg/g（均 P＜0.01），見圖 3。

圖3 3組豬心臟瓣膜組織殘留DNA含量比較

2.4 3組豬心臟瓣膜組織殘留α-Gal抗原比較 與未處理組（0.61±0.07）相比，實驗組無明顯的α-Gal抗原殘留（0.02±0.01），而對照組仍有少量 α-Gal抗原殘留（0.14±0.02），后兩組的抗原殘留均低于未處理組（均 P＜0.01），見圖 4。

圖4 3組豬心臟瓣膜組織殘留α-Gal抗原比較（a：3組標本的α-Gal電泳圖；b：相對灰度值的比較，**P＜0.01）

2.5 3組豬心臟瓣膜組織抗鈣化潛能比較 大鼠皮下包埋2周后，實驗組出現輕微鈣化結節，平均結節數為（44±12）個/mm2；而對照組鈣化結節較多，平均結節數為（157±21）個/mm2。兩組鈣化結節數量均低于未處理組的（697±165）個/mm2（均P＜0.01），見圖5（插頁）。

圖5 3組豬心臟瓣膜組織抗鈣化潛能比較（a：3組豬心臟瓣膜組織的茜素紅染色所見，×200；b：單位面積的鈣化結節數比較，**P＜0.01）

3 討論

經典的TEHV構建方法是按照組織工程學原理，先構建具有心臟瓣膜形態的支架，然后在支架上種植自體活細胞，細胞在支架上生長并逐漸對原來的支架進行改建，最終形成完全由自體細胞和基質所構成的瓣膜組織。目前組織工程瓣膜的發展尚需克服當前建模材料的臨床應用局限性，才有可能徹底改變瓣膜置換手術的現狀[9-10]。由于異種移植物具有幾乎無限的可用性，因此可以作為理想的供體組織類型[4]。本研究采用豬心臟瓣膜為研究對象，通過對脫細胞瓣膜的結構完整性、免疫原性及抗鈣化等分析，明確了其作為TEHV支架材料的可行性和潛在優勢。

支架材料為種子細胞提供一個生長、發育、分泌細胞外基質及發揮其他功能的生物學空間，同時也為鄰近細胞遷移、生長、分化提供良好的微環境，為TEHV構建提供了細胞載體與組織結構平臺。良好的細胞外支架應具備生物相容性良好、表面活性利于細胞黏附與增殖、適宜的生物降解性、力學性能好等優點[11-12]。前期研究證實，乙酸和膠原酶方案盡管能分離出基質成分，但會破壞機械性能[13]。真空冷凍干燥是提高脫細胞材料支架孔隙率的方法，但一些研究發現真空冷凍干燥會導致膠原蛋白破裂，組織機械性能有所下降[14-15]。本研究中采用液氮凍融聯合胰蛋白酶消化和SDS的方法，既有效清除了細胞及DNA殘留，又保證了組織結構的完整性，是瓣膜材料的優化脫細胞方法。

成熟TEHV的構建需要脫細胞基質框架支持種植細胞的生長黏附。研究證實骨髓間充質干細胞是目前TEHV再細胞化的首選細胞群，但種植后細胞生長會出現極性缺失、排列松散、黏附力較低等問題[16-17]。因此，在脫細胞去除免疫原性的同時，不破壞基質細胞生長黏附的性能顯得尤為重要。目前，各種類型的涂層具備良好的細胞生長特性，顯著提升脫細胞支架的細胞附著性能，如PHBHHx涂層[18]、鈦基表面納米銀復合涂層[19]、Galectin-8[20]等。本研究中采用液氮凍融聯合胰蛋白酶消化和SDS的方法，在基質完整性保持方面具有較好的效果，但對于種植細胞的黏附生長等方面的特性還需進一步研究，為生物材料的組織工程瓣膜發展提供實驗數據。

本研究采用液氮凍融聯合胰蛋白酶消化對豬心臟瓣膜進行脫細胞處理，可有效去除殘余細胞成分，降低免疫排斥反應；保留基質結構完整性，維持天然的組織結構和功能；具有一定的抗鈣化效果，延長生物材料的潛在使用期。運用該方法獲得的脫細胞豬心臟瓣膜，可作為TEHV的優質支架材料。