二甲雙胍增強膽管癌細胞對吉西他濱敏感性機制的研究

鄧海山 俞文隆

膽管癌是一種死亡率極高的惡性腫瘤，無明顯早期癥狀且病程進展迅速[1]。腫瘤細胞的侵襲性和對治療藥物的不敏感性是導致膽管癌不良預后的主要因素[2]。丙酮酸激酶 M2（pyruvate kinase M2,PKM2）是糖酵解途徑中一種重要的限速酶。PKM2在腫瘤細胞產生耐藥性過程中起到重要作用，而靶向作用于PKM2能夠有效提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。研究表明，PKM2表達的上調與腫瘤細胞對吉西他濱和順鉑的敏感性降低有關[3-4]。二甲雙胍是一種常用的口服降糖藥，體內及體外研究均發現其具有一定的抗癌作用，且可下調PKM2的表達，抑制腫瘤細胞的增殖[5-7]。線粒體是細胞的能量源，在腫瘤細胞增殖和分化中發揮著重要作用[8]。基于已有的研究，本研究將二甲雙胍用于膽管癌細胞，進一步探討二甲雙胍對PKM2表達的調控，進而闡明其增強膽管癌細胞對吉西他濱敏感性的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 10%FBS（批號：11875-093）和 1%青霉素鏈霉素（批號：15070-063）均購自美國GIBCO-Invitrogen公司；Trizol試劑（批號：15596-026）購自美國Ambion公司；qPCR檢測試劑盒（批號：QP001）購自廣州復能基因有限公司；PKM2激動劑ML265（批號：1221186-53-3）購自美國 Targetmol公司；二甲雙胍（批號：D9351）和吉西他濱（批號：G8970）均購自北京索萊寶科技有限公司；線粒體膜電位檢測（JC-1）試劑盒（批號：C2006）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）定量檢測試劑盒（批號：C0016）均購自中國碧云天生物技術公司；乳酸定量檢測試劑盒（批號：A019-2-1）購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器 實時熒光定量PCR儀（型號：QuantStudio 6）購自美國 Applied Biosystems（ABI）公司；微量分光光度計（型號：Nano-100）購自杭州奧盛儀器有限公司；酶標儀（型號：MULTISKAN MK3）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；細胞超聲破碎儀（型號：SCIENTZIID）購自寧波新芝生物科技股份有限公司；熒光顯微鏡（型號：IX51）購自奧林巴斯（中國）有限公司。

1.1.3 細胞 人膽管癌細胞HCC9810和RBE細胞系由中國科學院上海細胞庫提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組 人膽管癌細胞HCC9810和RBE在含有10%FBS和1%青霉素鏈霉素的RPMI 1640培養基中培養，置于37℃，5% CO2培養箱中孵育，并分為以下各組：（1）HCC9810/RBE+溶劑組：HCC9810/RBE細胞在含有終濃度5%二甲基亞砜（DMSO）的培養基中培養；（2）HCC9810/RBE+吉西他濱組：HCC9810/RBE細胞在含有終濃度為100 nmol/L吉西他濱（溶于5%DMSO）的培養基中培養；（3）HCC9810/RBE+二甲雙胍+吉西他濱組：HCC9810/RBE細胞在含有終濃度為10 mmol/L二甲雙胍和100 nmol/L吉西他濱（溶于5%DMSO）的培養基中培養；（4）HCC9810/RBE+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組：HCC9810/RBE細胞在含有終濃度為10 mmol/L二甲雙胍、100 nmol/L吉西他濱和100 nmol/L ML265（溶于 5%DMSO）的培養基中培養。各組細胞均培養48 h。

1.2.2 細胞存活率檢測 采用噻唑藍（MTT）染色法。將 HCC9810和RBE細胞系（5×104個/孔）接種于 96孔細胞培養板中，貼壁培養12 h。按上述分組，細胞加入藥物干預后，參考文獻[9]方法，吸出培養基，加入150 μl DMSO，震蕩10 min，用酶標儀檢測570 nm波長處吸光度（optical density,OD）值；Blank為不加細胞只加培養基。細胞存活率=（測試組OD570nm-Blank OD570nm）/（正常培養組OD570nm-Blank OD570nm）×100%。

1.2.3 細胞PKM2 mRNA表達水平檢測 采用qRTPCR法。用Trizol試劑提取各組細胞中總RNA，然后進行反轉錄，并應用qPCR檢測試劑盒進行PCR檢測。PKM2引物序列：正向引物：5'-GACGGAGGTGGAAAATGGTG-3'，反向引物：3'-CAGATGCCTTGCGGATGAAT-5'。PCR循環過程：95℃ 10 min預變性，95℃ 15 s變性，60℃退火延伸60 s，40個循環。應用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.2.4 細胞培養基乳酸含量測定 藥物處理各組細胞后，收集細胞培養基，離心取上清液。根據乳酸定量檢測試劑盒操作方法進行檢測，待測樣品用分光光度計檢測450 nm波長處OD值，根據試劑盒對照樣品檢測所得標準曲線計算乳酸含量。

1.2.5 細胞LDH活性檢測 藥物處理各組細胞后，收集細胞加入PBS，利用細胞超聲破碎儀在冰上破碎細胞制成細胞懸液。按照LDH定量檢測試劑盒操作手冊進行處理后，應用酶標儀檢測490 nm波長處OD值。根據試劑盒對照樣品檢測，LDH活性＝（樣品OD490nm－Blank OD490nm）/（標準管OD490nm－標準Blank OD490nm）×標準品濃度。

1.2.6 細胞線粒體凋亡檢測 采用JC-1染色法。細胞接種至小玻片上待長至單細胞層，4%多聚甲醛固定，然后加入1 ml JC-1染色工作液，充分混勻。細胞培養箱中37℃孵育20 min；孵育結束后，吸除上清液，用JC-1染色緩沖液洗滌2次；加入2 ml細胞培養液；熒光顯微鏡下觀察并拍照。綠色熒光增強，紅色熒光減弱，表明線粒體凋亡增加。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 6.0統計軟件。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計意義。

2 結果

2.1 各組細胞存活率比較 與HCC9810+溶劑組比較，HCC9810+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組細胞存活率均降低（均P＜0.05）；與HCC9810+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組細胞存活率降低（P＜0.05）；與 HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組細胞存活率升高（P＜0.05）。RBE細胞各組的細胞存活率結果與HCC9810細胞類似，見圖1。

圖1 各組細胞存活率比較（a：HCC9810細胞經處理后各組細胞存活率比較；與HCC9810+溶劑組比較，*P＜0.05；與HCC9810+吉西他濱組比較，△P＜0.05；與HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組比較，▲P＜0.05；b：RBE細胞經處理后各組細胞存活率比較；與RBE+溶劑組比較，*P＜0.05；與RBE+吉西他濱組比較，△P＜0.05；與RBE+二甲雙胍+吉西他濱組比較，▲P＜0.05）

2.2 各組細胞PKM2 mRNA表達水平比較 與HCC9810+溶劑組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組PKM2 mRNA表達水平均降低（均P＜0.05）；與HCC9810+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組PKM2 mRNA表達水平均降低（均P＜0.05）；與HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組PKM2 mRNA表達水平升高（P＜0.05）。RBE細胞各組的PKM2 mRNA表達水平變化與HCC9810一致，見圖2。

圖2 各組細胞PKM2 mRNA表達水平比較（a：HCC9810細胞經處理后各組細胞PKM2 mRNA表達水平比較；與HCC9810+溶劑組比較，*P＜0.05；與HCC9810+吉西他濱組比較，△P＜0.05；與HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組比較，▲P＜0.05；b：RBE細胞經處理后各組細胞PKM2 mRNA表達水平比較；與RBE+溶劑組比較，*P＜0.05；與RBE+吉西他濱組比較，△P＜0.05；與RBE+二甲雙胍+吉西他濱組比較，▲P＜0.05）

2.3 各組細胞培養基乳酸含量比較 與HCC9810+溶劑組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組細胞培養基乳酸含量均降低（均 P＜0.05）；與 HCC9810+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組細胞培養基乳酸含量均降低（均P＜0.05）；HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組和HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組細胞培養基乳酸含量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。RBE細胞各組的細胞培養基乳酸含量結果與HCC9810類似，見圖3。

圖3 各組細胞培養基乳酸含量比較（a：HCC9810細胞經處理后各組細胞培養基乳酸含量比較；與HCC9810+溶劑組比較，*P＜0.05；與HCC9810+吉西他濱組比較，△P＜0.05；b：RBE細胞經處理后各組細胞培養基乳酸含量比較；與RBE+溶劑組比較，*P＜0.05；與RBE+ 吉西他濱組比較，△P＜0.05）

2.4 各組細胞LDH活性比較 與HCC9810+溶劑組比較，HCC9810+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組LDH活性均升高（均P＜0.05）；與HCC9810+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組LDH活性均升高（均P＜0.05）；與HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組LDH活性降低（P＜0.05）。RBE細胞各組的LDH活性結果與HCC9810類似，見圖4。

圖4 各組細胞LDH活性比較（a：HCC9810細胞經處理后各組細胞LDH活性比較；與HCC9810+溶劑組比較，*P＜0.05；與HCC9810+吉西他濱組比較，△P＜0.05；與HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組比較，▲P＜0.05；b：RBE細胞經處理后各組細胞LDH活性比較；與RBE+溶劑組比較，*P＜0.05；與RBE+吉西他濱組比較，△P＜0.05；與RBE+二甲雙胍+吉西他濱組比較，▲P＜0.05）

2.5 各組細胞線粒體凋亡情況比較 與HCC9810+溶劑組比較，HCC9810+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組細胞線粒體凋亡均增加（綠色熒光增強，紅色熒光減弱）；與HCC9810+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組細胞線粒體凋亡均增加（綠色熒光增強，紅色熒光減弱）；與HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265細胞線粒體凋亡減少（綠色熒光減弱，紅色熒光增強）。RBE細胞各組的線粒體凋亡結果與HCC9810類似，見圖5（插頁）。

圖5 各組細胞線粒體凋亡情況比較（線粒體膜電位檢測染色，×200）

3 討論

癌細胞傾向于貪婪地吸收葡萄糖進行糖酵解，以調節腫瘤的發展、維持和轉移，該過程被稱為“Warburg效應”[10]。與正常細胞相比，腫瘤細胞的糖酵解率增加大約30倍，這一特點促進了糖酵解靶向抗腫瘤治療新方法的探索[11]。二甲雙胍是一種常用的口服降糖藥物，可通過腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路抑制Warburg效應[12]，發揮抗腫瘤作用[5-6]。PKM2在腫瘤細胞中高度表達，并在Warburg效應和腫瘤耐藥中發揮重要作用。既往研究發現，耐藥癌細胞表現出更高的糖酵解率，這表明以糖酵解途徑為突破點可能是降低癌細胞耐藥性的一種新的研究方向[13]。最新研究表明，PKM2高表達預示肝內膽管癌惡性程度，且與不良預后有關[14]。本研究探討二甲雙胍對PKM2的表達調控，進而闡明其促進膽管癌細胞對吉西他濱敏感性的機制。

膽管癌主要是肝門部膽管癌，是膽管系統的第二大腫瘤。由于膽管癌的隱匿性發病和高度惡性，患者預后較差。膽管癌患者平均生存時間約為1年，5年生存率＜10%。即使是根治性手術切除后，患者5年生存率也只有20%～40%[15]。化療敏感性仍然是影響患者生存率的最重要因素之一。在本研究中，體外培養膽管癌細胞株HCC9810和RBE細胞，并用化療藥物吉西他濱、二甲雙胍處理細胞，結果表明，與吉西他濱單獨處理相比，二甲雙胍聯合吉西他濱處理后明顯降低了細胞存活率。乳酸是主要的糖酵解產物，具有促進腫瘤增殖和轉移作用[16]。LDH是糖酵解的關鍵酶之一，是維持細胞糖酵解不可或缺的部分[17]。本研究結果表明，二甲雙胍聯合吉西他濱明顯降低細胞培養基乳酸含量，提高細胞LDH活性。JC-1染色結果表明，二甲雙胍增加了吉西他濱的促線粒體凋亡作用。以上結果表明，二甲雙胍和吉西他濱在抑制膽管癌細胞增殖及促進膽管癌細胞線粒體凋亡方面表現出協同作用。在機制的研究中發現，二甲雙胍聯合吉西他濱抑制了HCC9810和RBE細胞中PKM2的表達；PKM2激動劑ML265減弱了二甲雙胍聯合吉西他濱對膽管癌細胞促凋亡作用，說明PKM2可能介導二甲雙胍協同吉西他濱的促凋亡作用。

綜上所述，本研究發現二甲雙胍可能通過抑制膽管癌細胞PKM2的表達、激活線粒體凋亡來增強膽管癌細胞對吉西他濱的敏感性。