谷胱甘肽過氧化物酶4在雷公藤內酯酮激活結腸癌細胞鐵死亡中的作用

李慧霞 尤偉波 陳麗 王建平

結腸癌是全球范圍內較為常見的消化道惡性腫瘤之一，極大威脅著人類的健康[1]。外科手術切除是其最佳治療手段，但多數患者診斷時已處于中晚期，失去了最佳的手術機會[2-3]。盡管放化療、分子靶向藥物、免疫檢查點抑制劑等治療能有效提高結腸癌的治療緩解率，但結腸癌、直腸癌的5年生存率僅為57.6%和56.9%[1]。因此，亟需探索新的抗腫瘤療法。雷公藤內酯酮（triptoinde，TN）是從雷公藤根莖分離提取的三萜類化合物，具有廣泛的抗癌作用[4-8]；但其在結腸癌中的作用及相關機制目前尚未明確。細胞鐵死亡是一種鐵離子依賴的脂質氧化物過載誘發的調節性死亡，研究證實多種抗癌藥物可通過激活細胞鐵死亡來發揮抗癌作用[9-10]。因此，本研究對細胞鐵死亡關鍵調控蛋白谷胱甘肽過氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4）在TN激活結腸癌細胞鐵死亡中的作用作一探討，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 試劑和細胞 TN（批號：38647-11-9，純度≥97%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，GPX4抗體（批號：ab125066）、β-actin（批號：ab6276）購自英國Abcam公司，陰性載體（批號：GVAP0200268）購自上海吉凱基因科技有限公司，GPX4過表達載體（批號：GOSV0282718）購自上海吉凱基因科技有限公司，活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（批號：S0033S）、CCK-8（批號：C0038）、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號：S0131S）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒（批號：S0053）、Calcein AM/PI細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒（批號：C2015S）、二甲基噻唑二苯基四氮唑溴鹽[3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]溶液（批號：C0009S）均購自上海碧云天生物科技有限公司。結腸癌細胞株HCT116購自中國醫學科學院細胞庫。本實驗在浙江大學醫學院完成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將HCT116細胞置于含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的杜爾伯科改良伊格爾培養基中，放在37℃、5% CO2、飽和濕度的孵育箱中培養；每隔1 d更換1次培養基。

1.2.2 細胞分組與處理 將體外培養的HCT116細胞分為5組，即對照組、TN組、鐵死亡抑制劑Feroptosis-1（Fer-1）+TN組、陰性載體組、GPX4過表達組。對照組細胞不作任何處理。TN組細胞加入15.0 nmol/L的TN處理48 h。Fer-1組細胞用2 μmol/L Fer-1預處理2 h后，加入15 nmol/L TN處理48 h；陰性載體組、GPX4過表達組細胞分別用 10 μl陰性載體、10 μl GPX4過表達轉染48 h后，加入15 nmol/L TN處理48 h。

1.2.3 細胞轉染 陰性載體和GPX4過表達載體由吉凱基因科技有限公司合成。將1×105個HCT116細胞接種于6孔板，用無雙抗、無血清的培養基培養，待細胞融合至70%～80%時進行病毒轉染。按照說明書方法分別取10 μl陰性載體、GPX4過表達載體加入細胞中，繼續培養12 h后觀察細胞狀態。在熒光顯微鏡下觀察轉染情況，經轉染后12、24、48 h加入嘌呤霉素，獲取陰性載體和GPX4過表達表達細胞。

1.2.4 細胞存活率檢測 采用CCK-8法。HCT116細胞按0.2×103個/孔接種至96孔板中，置于培養箱過夜，待貼壁后加入 0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 nmol/L的TN繼續培養 48 h。每孔加入20 μl MTT溶液，37℃溫箱反應2～4 h，使用酶標儀在波長562 nm處檢測吸光度（optical density，OD）值。細胞存活率=（OD 值給藥組-OD 值空白孔/OD 值對照組-OD 值空白孔）×100%。

1.2.5 死亡細胞比例檢測 采用死細胞染色法。5組HCT116細胞經藥物處理后，用PBS輕輕洗去培養基，加入經檢測緩沖液稀釋1 000倍的Calcein AM/PI工作液500 μl，室溫下避光孵育30 min。使用熒光顯微鏡拍攝細胞染色情況并統計死亡細胞比例。

1.2.6 細胞內GSH含量檢測 5組HCT116細胞經藥物處理后，用PBS輕輕洗滌1次，1 500 r/min離心5min，取細胞沉淀，加入蛋白去除試劑充分混勻；再加入液氮，37℃反復凍融2次，冰上靜置5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液。根據GSH檢測試劑盒說明書制作標準品，加樣后使用酶標儀在波長412 nm處檢測OD值，根據不同濃度標準品測得的OD值作出標準曲線，以對照組為參照，計算細胞內GSH相對含量。

1.2.7 細胞內ROS含量檢測 采用流式細胞術檢測。5組HCT116細胞經藥物處理后，用PBS輕輕洗滌1～2次，制備細胞懸液。加入適量10 μmol/L的二氯熒光黃雙乙酸鹽稀釋液對重懸細胞進行染色，置于37℃培養箱內孵育20 min，轉至流式細胞儀進行檢測，獲得平均熒光強度值，以對照組為參照，計算細胞內ROS相對含量。

1.2.8 細胞內MDA含量檢測 5組HCT116細胞經藥物處理后，用PBS輕輕洗滌1～2次，加入細胞裂解液充分混勻，待細胞裂解完全后，取0.1 ml裂解液，加入0.2 ml MDA檢測工作液，置于100℃金屬浴中15 min后，1 500 r/min離心5 min，取上清液。使用酶標儀在波長532 nm處檢測OD值，以對照組為參照，計算細胞內MDA相對含量。

1.2.9 細胞GPX4蛋白表達水平檢測 將上述5組細胞裂解液0.1 ml，置于4℃離心機，12 000 r/min離心15 min，取上清液。每孔20 μg總蛋白用10%聚丙烯酰胺梯度凝膠進行電泳分離1.5～2.0 h，采用濕轉法將蛋白轉至聚偏氟乙烯膜2 h，取出聚偏氟乙烯膜后用10%脫脂牛奶室溫下封閉30 min，根據目標蛋白的分子量裁膜后，分別加入GPX4、β-actin一抗，4℃孵育過夜；取聚偏氟乙烯膜洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育1 h，洗滌3次，利用電化學發光技術進行顯影和定影，使用Image J軟件計算各個條帶的灰度值，即蛋白表達水平。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 5.0統計軟件。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度TN處理48 h后HCT116細胞存活率比較 隨著TN濃度的增加，HCT116細胞存活率逐漸下降（P＜0.05），見圖 1。TN對 HCT116細胞的半抑制濃度 （half maximal inhibitory concentration，IC50）為15.37 nmol/L，故本研究選擇最接近IC50的濃度15 nmol/L為TN給藥終濃度。

圖1 不同濃度雷公藤內酯酮處理48 h后HCT116細胞存活率比較

2.2 5組HCT116死亡細胞比例比較 5組HCT116死亡細胞比例比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，TN組死亡細胞比例明顯升高（P＜0.05）；與TN組比較，Fer-1組死亡細胞比例明顯降低（P＜0.05）；與陰性載體組比較，GPX4過表達組死亡細胞比例明顯降低（P＜0.05），見圖 2（插頁）。

圖2 5組HCT116死亡細胞比例比較（a：細胞染色圖，綠色熒光所示為活細胞，紅色熒光所示為死細胞；b：柱狀圖，*P＜0.05）

2.3 5組 HCT116細胞內 GSH、ROS、MDA含量比較5組HCT116細胞內GSH、ROS、MDA含量比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與對照組比較，TN組細胞內GSH含量明顯減少（P＜0.05），ROS、MDA含量均明顯增加（均P＜0.05）；與TN組比較，Fer-1組細胞內GSH含量明顯增加（P＜0.05），ROS、MDA含量均明顯減少（均P＜0.05）；與陰性載體組比較，GPX4過表達組細胞內GSH含量明顯增加（P＜0.05），ROS、MDA含量均明顯減少（均P＜0.05），見圖3。

圖3 5組HCT116細胞內GSH、ROS、MDA含量比較

2.4 5組HCT116細胞GPX4蛋白表達水平比較 與對照組比較，TN組細胞GPX4蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與TN組比較，Fer-1組細胞GPX4蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與陰性載體組比較，GPX4過表達組細胞GPX4蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 5組HCT116細胞GPX4蛋白表達水平比較（a：電泳圖；b：柱狀圖，*P＜0.05）

3 討論

TN屬于三萜類化合物，具有極強的抗癌活性。體外內研究發現，TN能明顯抑制胃癌、胰腺癌、肺癌等實體腫瘤細胞增殖[4-8]。Xiang等[4]研究發現，對于高侵襲、未分化的胃癌細胞，TN的IC50為5.1～11.1 nmol/L，而對正常胃細胞株 GES-1的 IC50為 20.2 nmol/L。Wang等[5]研究發現，TN對食管癌細胞株HONE-1的IC50為23.56 nmol/L，而5～500 nmol/L的TN對正常食管細胞株NP-69無細胞毒性。Zhang等[6]也研究證實，TN對多種胰腺癌細胞的IC50為10 nmol/L，對正常胰腺細胞株HSF的IC50＞50 nmol/L。本研究結果顯示，TN對HCT116細胞的IC50為15.37 nmol/L，提示TN對結腸癌細胞具有明顯細胞毒性作用，能抑制結腸癌細胞增殖。

細胞鐵死亡是由鐵離子依賴的脂質過氧化物異常堆積導致的一種新型細胞死亡方式[9]，特征性表現為脂質過氧化物及ROS過量蓄積；在形態學上表現為細胞縮小，線粒體嵴消失或減少、線粒體內外膜濃縮；在分子水平上表現為GPX4活性減弱、GSH耗竭、脂質氧化物無法被還原。在二價鐵離子的催化下，脂質氧化物被氧化，從而產生大量ROS，導致細胞氧化應激損傷性死亡。然而，多種腫瘤細胞能夠適應性維持細胞內過氧化脂質代謝平衡，保護細胞免受鐵死亡損害。其中GPX4是降低脂質過氧化物含量的一種重要酶類，能催化脂質過氧化物還原，降低細胞內脂質過氧化物含量，抑制細胞鐵死亡[11-12]。研究表明，GPX4抑制劑能誘發癌細胞鐵死亡，發揮抗癌作用[9]。Hou等[13]研究表明，二甲雙胍通過降低GPX4表達來激活細胞鐵死亡，從而抑制乳腺癌細胞增殖。Gao等[14]研究發現，布洛芬能降低GPX4表達，從而發揮抗膠質瘤的作用。Zhang等[15]研究表明，GPX4抑制劑RSL3能明顯增加順鉑的化療敏感性。本研究結果顯示，TN能增加HCT116細胞內ROS、MDA含量，同時降低GSH含量；TN+Fer-1組細胞內ROS、MDA含量較TN組均明顯減少，而GSH含量明顯增加，這說明TN能激活HCT116細胞鐵死亡。進一步研究發現，TN能抑制GPX4表達，并被Fer-1部分逆轉；經GPX4過表達后，TN誘導的ROS、MDA含量均明顯減少，GSH含量明顯增加，這說明GPX4參與TN激活HCT116細胞鐵死亡的過程?？梢姡琓N具有抗結腸癌的作用，而GPX4是TN抗癌的關鍵靶點，通過調控TN激活癌細胞鐵死亡作用。

綜上所述，TN通過抑制GPX4激活結腸癌細胞鐵死亡，從而抑制癌細胞增殖。