永康地區耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥表型及分子分型分析

呂美艷 王麗之 胡蘇球 應雄江 陳櫟江

肺炎克雷伯菌被認為是引起醫院獲得性感染和社區獲得性感染的主要腸桿菌科細菌之一，可引起呼吸道、尿道、手術部位軟組織及血流感染等，嚴重者可危及生命[1]。國內于2007年首次在浙江發現質粒介導的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia,CRKP）[2]。隨后，全國各地報道了CRKP檢出情況[3-4]。近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應用，CRKP檢出率逐年上升，臨床抗感染治療形勢越來越嚴峻[5]。近年來，永康市第一人民醫院CRKP分離率明顯升高；因此本研究對該院臨床分離的CRKP臨床分布特征、耐藥表型、耐藥基因型及分子分型進行分析，旨在為本地區臨床CRKP抗感染治療和院內感染防控提供依據。

1 對象和方法

1.1 對象 選取永康市第一人民醫院2017年1月至2019年12月332例住院患者中分離到的332株非重復CRKP菌株為研究對象。質控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922、產酸克雷伯菌ATCC700324均購自國家衛生部臨床檢驗中心。

1.2 方法 隨機選取30株CRKP菌株，采用改良Hodge試驗、頭孢他啶/阿維巴坦紙片擴散法、PCR法檢測CRKP菌株耐藥表型及基因型，采用多位點序列分型（multi-locus sequence typing,MLST）檢測 CRKP菌株等位基因號及分子分型。

1.2.1 改良Hodge試驗 將0.5 MCF的大腸埃希菌ATCC25922菌液均勻涂布于MH平板（批號：20200826B，鄭州安圖生物有限公司），中間貼上厄他培南藥敏紙片（10 μg/片，批號：2953610，英國 Oxoid 公司），接種CRKP菌株；無菌接種環自紙片外緣向平板邊緣劃線，35℃孵育16～18 h后觀察結果。結果判斷：厄他培南抑菌圈內出現待檢菌矢狀生長為產碳青霉烯酶[6]。以經測序證實產KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌為陽性對照株，以產酸克雷伯菌ATCC700324為陰性對照株。

1.2.2 頭孢他啶/阿維巴坦紙片擴散法 將0.5 MCF的CRKP菌液均勻涂布于MH平板，中間貼上頭孢他啶/阿維巴坦藥敏紙片（30 μg/片，批號：SK20，溫州市康泰生物科技有限公司），35℃孵育16～18 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，參照CLSI M100-S29頭孢他啶標準判讀CRKP菌株對頭孢他啶/阿維巴坦的體外敏感性。

1.2.3 PCR檢測 制備細菌DNA模板，參照文獻[7]合成 blaKPC-2、blaIMP-1、blaVIM-1、blaOXA-48、blaNDM-1基因，引物序列見表 1。PCR 總反應體系 25 μl，包括 5 U/μl Taq DNA 聚合酶 0.3 μl、10×PCR buffer 2.5 μl、5 mmol/L dNTP mixture 1μl、待測菌 DNA 模板 2 μl、25 μmol/L下游引物 2 μl、25 μmol/L 下游引物 2 μl、ddH2O 15.2 μl。反應條件：94℃ 變性1 min；退火1 min，退火溫度見表1；72℃延伸90 s。取10 μl PCR產物經含Goldview的20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像儀（Chemi－DocXRS，美國Bio-Rad公司）觀察并分析PCR產物的電泳條帶；將陽性結果送上海桑尼公司進行測序，并與美國國家生物技術信息中心網站進行生物大分子序列比對，確定耐藥基因型。

表1 目的基因引物序列及產物長度

1.2.4 MLST檢測 根據選定的肺炎克雷伯菌7個管家基因（gapA、rpoB、mdh、pgi、phoE、infB、tonB，由上海桑尼生物公司合成）設計PCR擴增引物，使用PCR梯度擴增儀進行擴增，擴增條件：94℃變性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸30 s。擴增產物純化后測定各位點片段的DNA序列，將拼接后的測序結果提交至Genbank，將7個管家基因序列與肺炎克雷伯菌MLST數據庫（http://pubmlst.org/）相應等位基因進行比較，獲得每個菌株的等位基因號，確定分子分型。

2 結果

2.1 CRKP菌株的患者性別、年齡、標本及科室來源分布 332株CRKP菌株來自男性患者239株（72.0%），女性患者93株（28.0%）；來自＞60歲患者246株（74.1%），21～60歲患者 74株（22.3%），＜20歲12株（3.6%）；標本來源主要為痰液233株（70.2%）、尿液63株（19.0%）、血液14株（4.2%）、排泄物9株（2.7%）；科室來源主要為 ICU 168株（50.6%）、呼吸內科病房 31株（9.3%）、神經外科病房27株（8.1%）。

2.2 CRKP菌株對抗菌藥物的敏感性試驗結果 CRKP菌株對復方新諾明、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星、四環素的敏感性較高，分別為71.9%、48.0%、38.6%、32.2%、31.7%；對亞胺培南、哌拉西林、美洛培南、氨芐西林/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦的敏感性較低，分別為1.2%、4.5%、6.1%、7.9%、8.0%。

2.3 30株CRKP菌株耐藥表型及基因型檢測結果30株CRKP菌株的改良Hodge試驗陽性率為90.0%（27/30）；對頭孢他啶/阿維巴坦的體外敏感性為96.7%（29/30）；耐藥基因型為 blaNDM-1僅 1株（3.3%），blaKPC-229株（96.7%），見表 2。

表2 30株CRKP菌株耐藥表型及基因型檢測結果

2.4 30株CRKP菌株等位基因號及分子分型 30株CRKP菌株中，分子分型為ST11型28株，占93.3%，見表3。

表3 30株CRKP菌株等位基因號及分子分型

3 討論

近年來，全國CRKP檢出率逐年升高，提示CRKP醫院感染防控工作刻不容緩。因此，本研究對2017—2019年永康市第一人民醫院臨床分離的CRKP菌株進行分析，探討其臨床分布特征、耐藥表型、耐藥基因及同源性。本研究結果顯示，332株CRKP菌株主要來源于ICU（占50.6%），感染患者的年齡普遍＞60歲（占74.1%），這與ICU患者高齡者較多有關，因為高齡患者往往合并較多基礎疾病且免疫力低下[8]。此外，永康市第一人民醫院患者中分離獲得的CRKP菌株主要來源于痰液標本（占70.2%），提示CRKP主要通過呼吸道傳播，與周開礦等[9]報道一致。本研究還發現永康市第一人民醫院分離獲得的CRKP主要來源于男性患者（占72.0%），與萬玉香等[10]報道一致。

研究表明，CRKP對抗菌藥物的耐藥機制主要是產生碳青霉烯酶[11]。本研究結果顯示，30株CRKP菌株的改良Hodge試驗陽性率為90.0%；對頭孢他啶/阿維巴坦的體外敏感性為96.7%，與耐藥基因型檢測結果（1株CRKP菌株攜帶blaNDM-1，29株CRKP菌株攜帶blaKPC-2）一致。這提示頭孢他啶/阿維巴坦對產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌具有較好的抗菌作用。INFORM全球抗生素監測數據報告顯示，在2014—2016年我國住院患者中，肺炎克雷伯菌對頭孢他啶/阿維巴坦的體外敏感性達96.7%，與本研究結果基本一致。可見，頭孢他啶/阿維巴坦紙片擴散法用于篩查CRKP具有較高的靈敏度和特異度。但由于本研究僅對30株CRKP菌株進行試驗，具有一定的局限性，仍有待后續擴大檢測數來進一步證實。此外，本研究還對30株CRKP菌株進行同源性分析，以確定院內感染可能的流行株。MLST是用于細菌同源性分析的常用方法[12-13]。本研究采用MLST技術檢測細菌同源性發現，28株CRKP菌株為 ST11 型，占 93.3%，與 Liu 等[14]、Qi等[15]報道一致。

綜上所述，CRKP是永康地區感染性疾病的重要病原菌，對多數抗菌藥物具有高度耐藥性，流行株為ST11型。建議本地區醫療機構根據這一流行特點，進一步加強醫院感染預防與控制工作，比如嚴格加強感染患者隔離、醫護人員衛生防護、醫療物品及環境空氣消毒等措施，以預防CRKP傳播。