阿托伐他汀對小鼠川崎病的治療作用及機(jī)制研究

嚴(yán)曉華，王 娜，馬 娟，閆鮮鵬，鄭千千

(1.陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安 710068；2.西安市第九醫(yī)院兒科，陜西 西安 710054)

川崎病1967年首次由Tomisaku Kawasaki描述，是一種以全身中、小動脈炎性病變?yōu)橹饕±碜兓募毙詿嵝?、全身性血管炎，好發(fā)于5周歲以下兒童[1-3]。近年來，其發(fā)病率逐年升高。合并冠脈病變的發(fā)生率高達(dá)20%～25%，嚴(yán)重者可出現(xiàn)冠狀動脈瘤，遠(yuǎn)期可出現(xiàn)瘤體破裂或者栓塞導(dǎo)致缺血性心臟病，已經(jīng)取代風(fēng)濕熱成為兒科最常見的后天性心臟病，對兒童的身心成長危害很大[4-5]。本病的預(yù)后取決于冠狀動脈損害的程度。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)治療(免疫球蛋白沖擊聯(lián)合阿司匹林)，大部分患兒可取得良好的治療效果，但仍有部分患兒表現(xiàn)為對靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)不敏感。隨著對川崎病發(fā)病機(jī)制及病因的研究，一些新的治療方法不斷出現(xiàn)，包括英夫利昔單抗、甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺、阿那白滯素、血漿置換、他汀類藥物等[6]，但臨床治療的作用機(jī)制還處于探索之中。本研究觀察阿托伐他汀對小鼠川崎病的治療作用，并分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性10周齡BALB/c小鼠60只[許可證號：SYXK(陜)2012-005]，體重(17.0±0.5)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。每天觀察小鼠基本情況，包括活動量、飲水量、進(jìn)食量及體重。

1.2 主要試劑和儀器 乳酸菌MRS肉湯培養(yǎng)基；阿托伐他汀鈣片(批號：20190731，齊魯制藥海南有限公司)；流式細(xì)胞檢測儀(美國BD公司)；小動物超聲儀(加拿大VISUALSONIC公司);恒溫培養(yǎng)搖床(上海和呈儀器制造有限公司)；酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國SHELLAB公司)。

1.3 實驗分組 按隨機(jī)法將小鼠分為模型組、對照組和實驗組，每組20只。在實驗開始，給予模型組和實驗組干酪乳桿菌細(xì)胞壁成分(LCWE)0.5 mg腹腔注射，對照組給予0.9%氯化鈉溶液0.5 ml。實驗組在第5天口服阿托伐他汀(10 mg/d)，模型組和對照組均腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。LCWE制備：干酪乳桿菌常規(guī)培養(yǎng)于乳酸菌肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)質(zhì)譜儀鑒定為類干酪乳桿菌類干酪種，經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)、酶消化、超聲破碎等步驟后進(jìn)行LCWE提取，分別裝在1.5 ml EP管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩ALB/c小鼠經(jīng)腹腔單次注射0.3 ml LCWE，連續(xù)2次，以誘導(dǎo)川崎病模型。

1.4 心臟高分辨超聲心動圖檢查 用異氟烷氣體麻醉小鼠后，將脫毛膏涂于左胸前區(qū)，1 min后用棉簽擦拭干凈。取仰臥位，胸部涂超聲耦合劑，分別記錄LCWE注射后4、14、28 d心臟超聲檢查結(jié)果，主要包括左、右冠狀動脈的測量值。

1.5 心臟病理檢查 小鼠做完心臟超聲檢查后立即處死，解剖心臟標(biāo)本，行冰凍切片后HE染色，觀察血管彈力纖維連續(xù)性變化。

1.6 實驗室指標(biāo)檢測 把小鼠(每組8只)心臟組織打成組織勻漿，通過蛋白質(zhì)印跡和電泳遷移率實驗方法(EMSA)檢測心臟組織核因子(NF)-κB表達(dá)量及活性，通過蛋白質(zhì)印跡法和明膠酶譜法檢測心臟組織基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9表達(dá)量及活性。試劑(批號：20200819、20200723)購于美國Proteintech公司。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠行為學(xué)變化 在LCWE單側(cè)腹腔注射1～2 h左右，部分小鼠出現(xiàn)毛發(fā)紊亂、易激惹、活動力下降，以及進(jìn)食和體重等變化。在LCWE單側(cè)腹腔注射12 h后，與對照組小鼠比較，模型組小鼠活動和進(jìn)食量減少，部分出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)。

2.2 小鼠超聲心動圖檢查結(jié)果 見圖1。LCWE腹腔注射后4 d，左冠狀動脈主干內(nèi)徑增寬，約0.255 mm，內(nèi)膜增厚，約0.105 mm。注射后15 d，冠狀動脈明顯增寬。注射后24 d，出現(xiàn)右冠狀動脈瘤。阿托伐他汀治療10 d后，左冠狀動脈主干內(nèi)徑減小。

A：LCWE腹腔注射后4 d；B：LCWE腹腔注射后15 d；C：LCWE腹腔注射后24 d；D：阿托伐他汀治療10 d后

2.3 小鼠心臟組織病理檢查結(jié)果 模型組第15天，左心室內(nèi)膜局部內(nèi)皮細(xì)胞脫落，其上形成白色血栓，內(nèi)膜及肌壁間局部偶見少數(shù)中性粒細(xì)胞浸潤(圖2A)；右冠狀動脈管腔擴(kuò)張及少量心肌細(xì)胞壞死崩解(圖2 B、C)；冠狀動脈管壁增厚，管腔狹窄，腔內(nèi)可見白色血栓形成(圖2D、E)；主動脈瓣、二尖瓣輕度腫脹，少數(shù)中性粒細(xì)胞散在浸潤(圖2F)；心外膜間質(zhì)水腫，可見少量淋巴細(xì)胞浸潤及纖維結(jié)締組織彌漫輕度增生(圖2G)；局部纖維結(jié)締組織顯著增生并伴有固體鈣鹽沉著(圖2H)。實驗組在阿托伐他汀干預(yù)10 d后，小鼠左心耳外膜局部可見多量淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，未見明顯血管炎性反應(yīng)及其他明顯異常(圖2I)。

A-H：模型組第15天小鼠心臟組織HE染色結(jié)果(A-E ×40，F(xiàn)、H ×20，G ×10)；I：實驗組阿托伐他汀干預(yù)10 d后小鼠心臟組織HE染色結(jié)果(×200)

2.4 各組小鼠心臟組織NF-κB表達(dá)量及活性比較 見表1。模型組第14、28天NF-κB表達(dá)量高于對照組和實驗組(均P<0.01)，實驗組和對照組NF-κB表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組第14、28天NF-κB活性明顯高于對照組和實驗組(均P<0.01)，且實驗組NF-κB活性明顯高于對照組(P<0.05)。

表1 各組小鼠心臟組織NF-κB表達(dá)量及活性比較(μg/L)

2.5 各組小鼠心臟組織MMP-9表達(dá)量及活性比較 見表2。模型組第14、28天MMP-9表達(dá)量及活性高于對照組和實驗組(均P<0.05)，實驗組和對照組MMP-9表達(dá)量及活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表2 各組小鼠心臟組織MMP-9表達(dá)量及活性比較(μg/L)

3 討 論

川崎病是一種急性自限性發(fā)熱性出疹性疾病[7]。冠狀動脈的損傷中，冠狀動脈瘤的形成是最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥[8-10]。目前除了常規(guī)丙種球蛋白、阿司匹林、雙嘧達(dá)莫為一線治療方案外，臨床上丙種球蛋白不敏感性川崎病、川崎病合并冠狀動脈病變、冠狀動脈瘤形成的診治是常遇到的瓶頸問題。目前焦點主要在激素的選取上[11-13]。本實驗分為兩個部分：第一部分是川崎病小鼠造模相關(guān)研究，從實驗情況看，給予腹腔注射LCWE免疫BALB/c小鼠來造模的方法是可取的；第二部分為阿托伐他汀的治療探索問題，通過檢測蛋白表達(dá)量及活性來判斷阿托伐他汀對NF-κB和MMP-9的影響，觀察阿托伐他汀的作用機(jī)制，為臨床使用提供理論依據(jù)。

在整個實驗操作過程中，給予小鼠LCWE注射后，我們通過小鼠的行為表現(xiàn)，超聲、病理切片等檢查發(fā)現(xiàn)，模型組與對照組相比，小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)有明顯差異，且超聲提示冠狀動脈內(nèi)徑增寬。模型組HE染色后，在冠狀動脈局部可以看到炎性細(xì)胞浸潤。而對照組病理檢查結(jié)果未見明顯異常。LCWE免疫所致小鼠模擬了川崎病冠狀動脈損傷的病理過程，說明造模是成功的。同時，將實驗組(阿托伐他汀治療)和模型組對比發(fā)現(xiàn)，心臟標(biāo)本HE染色顯示冠狀動脈局部炎性細(xì)胞浸潤的嚴(yán)重程度明顯減低。實驗結(jié)果初步說明，阿托伐他汀治療小鼠川崎病是有一定效果的。

本實驗發(fā)現(xiàn)，對照組NF-κB和MMP-9在表達(dá)量和活性方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，證明正常小鼠內(nèi)NF-κB和(或)MMP-9的生理狀態(tài)是穩(wěn)定的。有研究[14-15]證實，在川崎病合并冠狀動脈損傷患兒外周血中NF-κB高表達(dá)，表明NF-κB參與了其發(fā)病。此外，在川崎病合并冠狀動脈病變的發(fā)病機(jī)制中，MMP-9作為血管重建因子也起了關(guān)鍵作用[16-17]。并且MMP-9與NF-κB關(guān)系緊密[18]。本實驗結(jié)果提示，川崎病小鼠模型同樣存在NF-κB和MMP-9的過度表達(dá)和激活，再次證實了兩者在川崎病發(fā)病機(jī)制中的相互作用。另外，與模型組比較，實驗組第14、28天心臟及冠狀動脈組織NF-κB表達(dá)量減少，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而NF-κB活性明顯低于模型組，但高于對照組，說明阿托伐他汀可以抑制小鼠心臟組織NF-κB的過度表達(dá)與激活。給予小鼠腹腔注射LCWE后，MMP-9表達(dá)量和活性均出現(xiàn)上升，給予阿托伐他汀治療后其過度表達(dá)和激活受到抑制，說明MMP-9作為NF-κB的下游因子，其表達(dá)量及活性的變化與NF-κB是一致的[19-21]。

綜上所述，阿托伐他汀對小鼠川崎病具有一定的治療效果，其作用機(jī)制可能是抑制川崎病小鼠模型NF-κB和MMP-9過度表達(dá)與激活，從而減少血管炎的發(fā)生。另外，本實驗也存在一些不足之處：實驗設(shè)計的時間過短，在數(shù)據(jù)收集的時間點覆蓋不全，沒有完全兼顧急性期及恢復(fù)期實驗室數(shù)據(jù)的采集；在小鼠超聲技術(shù)存在一定的技術(shù)局限，無法與病理進(jìn)行逐一對比，后續(xù)將進(jìn)行更為深入的研究。