黑老虎果實不同部位次生代謝成分及其富集差異

高漸飛，周 瑋，文錫梅，楊 艷

（1.貴州科學院，貴州省山地資源研究所，貴州貴陽 550001；2.貴州工業職業技術學院，貴州貴陽 550008；3.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽 550014）

黑老虎（Kadsura coccineaLem.）又名冷飯團、布福娜、大葉五味子等，南五味子屬五味子科植物；分布于貴州、廣西、云南等地。其根為常用中藥[1-2]，現代科學研究顯示，其還具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗HIV、保肝等活性作用[3-6]。黑老虎果實為聚合果，外形奇特、被譽為“神奇之果”[7]；果肉似荔枝、口味獨特，單果重100～580 g。近10年來，被作為一種新型水果種植，但果實可食率較低、果皮較厚（占果重的32%～50%）、種子多（100～210粒，占果重的7%～10%），果肉-種子不易分離[8-9]，不耐貯運等嚴重制約著更進一步發展。對果實和果實副產物（果皮和種子）進行精深加工利用已成為解決其瓶頸的途徑之一[8-10]。果實中的次生代謝物是主要活性物質，決定著品質及其加工產品的功能活性[11]，了解其多樣性與富集格局對下一步的研究與開發利用非常重要。

當前研究顯示，果實中含蘇氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸等近20種氨基酸[9,12-13]，含8種飽和脂肪酸和4種不飽和脂肪酸[14]；維生素C、粗蛋白質、可溶性糖等常規營養成分及其鈣、鐵、鋅、鎂等微量元素優于龍眼、草莓、荔枝等水果[8,12]，證實果實有較高的營養和保健價值。而關于活性物質的鑒定，研究者主要關注該植物的根莖部位，已鑒定出木脂素和萜類202種[7]。廣泛靶向代謝組學能通過高通量化學分析技術對生物樣品中代謝產物進行定性和定量分析，已得到廣泛認可[14-16]。然而，目前關于黑老虎果實不同部位次生代謝物鑒定及其富集差異的研究報道較少。

本研究以黑老虎果實為材料，利用廣泛靶向代謝組學方法，超高效液相色譜串聯質譜（UPLCMS/MS）技術，高通量、高靈敏、廣覆蓋檢測果肉、果皮和種子的代謝物，解析其中的次生代謝成分，分析其在不同部位多樣性與富集差異，探究特有和高度富集成分，為在藥食領域開發利用提供物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑老虎果實 人工培育的6年植株所結，栽植于覆蓋80%遮陽網的塑料大棚，定期管理、長勢良好，于2020年10月11日隨機采摘數十株成熟果實，并選果型端正，果大（單果重＞250 g）的作為樣品，采樣地位于貴州省貴陽市烏當區下壩鎮普渡村。

SHIMADZU Nexera X2超高效液相色譜儀日本島津公司；Applied Biosystems 4500 QTRAP三重四級桿質譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；SBC18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 美國安捷倫公司；MM 400研磨儀 Retsch。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的預處理 果實經自來水洗凈后純凈水沖洗3次，將其分離成小漿果，置于小板上、用手術刀剖開剝離出果肉、果皮，用砂布包裹揉搓種子使其干凈，分別裝入10 mL離心管中。編號為果肉KF1-3，果皮KP1-3和種子KD1-3；然后迅速置于液氮中，隨后干冰保存轉運至-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。

將3組供試樣品放置于凍干機（Scientz-100F）中真空冷凍干燥，用研磨儀研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；準確稱取100 mg粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中；每30 min渦旋一次，每次持續30 s，共渦旋6次，樣本置于4 ℃冰箱過夜；離心（轉速12000 r/min，10 min）后，吸取上清，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾樣品，并保存于進樣瓶中用于分析。

1.2.2 色譜質譜采集條件 液相條件：色譜柱：Agilent SB-C181.8 μm，2.1 mm×100 mm；流動相：A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B相為乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脫梯度：0.00 min B相比例為5%，9.00 min內B相比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min，10.00～11.10 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量4 μL。

利用AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系統（配備了ESI Turbo離子噴霧接口）檢測電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），由Analyst 1.6.3軟件（AB Sciex）控制運行[17]。ESI源操作參數如下：離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓（IS）5500 V（正離子模式）/-4500 V（負離子模式）；離子源氣體I（GSI），氣體II（GSII）和簾氣（CUR）分別設置為50、60和25.0 Psi，參數設置為高。

1.3 樣本質控

質控樣本（Quality Control Samples，QC）由樣本提取物混合制備而成，用于分析樣本在相同的處理方法下的重復性。在儀器分析的過程中，每3個檢測分析樣本中插入一個質控樣本，以監測分析過程的重復性。

1.4 數據處理

基于邁維（武漢）生物技術有限公司MVDB V2.0數據庫和代謝物信息公共數據庫，根據二級譜信息進行物質定性，采用三重四極質譜多反應監測模式（Multi Reaction Monitor，MRM）對代謝物進行定量。獲得不同樣本的代謝物質譜分析數據后，利用軟件Analyst 1.6.3對物質質譜峰進行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質譜出峰進行積分校正。

根據正交偏最小二乘法判別模型（Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA）分析代謝組數據，進一步展示各組分之間的差異[18]。評價模型的預測參數有R2X，R2Y和Q2，其中R2X和R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率，Q2表示模型的預測能力，這3個指標越接近于1時表示模型越穩定可靠，Q2＞0.5時可認為是有效的模型，Q2＞0.9時為出色的模型。基于OPLS-DA結果，從獲得的多變量分析OPLS-DA 模型的變量重要性投影（Variable Importance in Projection，VIP），選取VIP≥1，fold change≥2 和fold change≤0.5 的代謝物為差異代謝物（Differentially Accumulating Metabolites，DAMs）。

2 結果與分析

2.1 次生代謝物的多樣性與豐度

在黑老虎果實中檢測出次生代謝成分共307個，其中果皮含272個、果肉286個、種子201個，3個部位相同180個。基于結構配置對其進行歸類，數量上以酚酸類化合物最多，占38.8%；其余依次是黃酮（27.7%）、木脂素和香豆素（13.4%）、萜類（10.4%）、生物堿（5.2%）、單寧（4.6%）。種子中酚酸、黃酮和萜類化合物數量明顯低于果肉和果皮，導致其次生代謝物多樣性不如二者（圖1）。

圖 1 黑老虎果實不同部位（果肉、果皮、種子）次生代謝物分布Fig.1 Distribution of secondary metabolites in different parts(pulp, peel and seed) of Kadsura coccinea fruit

通過值峰積累分析（圖2），次生代謝物豐度在3個部位呈現出明顯差異，果皮中豐度高達81.62×107，分別是果肉（25.61×107）和種子（24.38×107）的3倍多。這得益于果皮中類黃酮的高度富集，生物堿顯著上調，同時酚酸、單寧和萜類也都向上表達。黃酮類的顯著積累及酚酸的上調可能是果皮的一些活性，如抗氧化、抑菌和抑酶優于果肉和種子的物質基礎[19]。而果皮中積累了不少單寧，可能是口感苦澀的原因之一。

2.2 差異代謝組分

2.2.1 主成分分析 通過對樣本進行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），判別黑老虎果肉（KF1-3）、果皮（KP1-3）、種子（KD1-3）各樣本組之間及組內次生代謝物變異度大小。樣本PCA得分圖（圖3）顯示LC-MS分析所得原始數據在 PC1、PC2 兩種主成分中得到良好地呈現。在圖中，第1主成分的貢獻率為68.5%，第2主成分的貢獻率為24.3%，代表2個主成分能夠基本反映檢測樣的主要特征信息；樣本表現出明顯的分離趨勢，表明對各樣本數據處理結果可信，各樣本間存在明顯差異。

圖 2 黑老虎果實不同部位（果肉、果皮、種子）次生代謝物豐度Fig.2 Abundance of the secondary metabolites in different parts(pulp, peel and seed) of Kadsura coccinea fruit

圖 3 樣本 PCA 得分圖Fig.3 PCA score chart of total samples

2.2.2 OPLS-DA結果 為了鑒別出具體有哪些組分造成了分離現象，建立黑老虎果皮與果肉（KF vs KP）、果肉與種子（KF vs KD）之間的2組OPLS-DA 模型。2組比較OPLS-DA驗證結果顯示，模型具有很好的預測能力和可靠性，能夠很好地表現各組間代謝物的變化趨勢；對OPLS-DA 模型進行 200 次排列驗證，模型有意義（表1），可根據 VIP 值分析篩選其DAMs。

表1 2組比較的OPLS-DA 模型驗證值Table 1 The calculated OPLS-DA model values of the two pairwise groups

2.2.3 差異組分 根據DAMs選擇標準，KF vs KP篩選到175個DAMs， KF vs KD 有236個DAMs，2對照組中的DAMs都主要為酚酸和類黃酮。由于來自酚酸、木脂素和香豆素、萜類的DAMs數量遠多于KF vs KP，這使得KF vs KD有更多數量的DAMs。KF vs KP 中的DAMs以上調模式占主導，而KF vs KD中則以下調為主。2對照組中都為DAMs 的有129個，其中類黃酮數量最多（47個）、酚酸次之（37個）（表2）。由此可知，黑老虎果皮、果肉和種子之間顯著差異的代謝組分主要為類黃酮和酚酸成分。

表2 差異代謝物組成Table 2 Number of differentially accumulated metabolites and classes

2.3 特征和高度富集成分

2.3.1 木脂素 木脂素類成分認為是五味子屬植物的主要藥效成分，是五味子屬植物的重要化學標志物[20]。在黑老虎果實中共鑒定出木脂素類化合物36個，其中種子中最多（31個），果肉居中（26個），果皮最少（19個），3個部位共有14個（表3）。木脂素在3個部位的富集量差異較大，在果皮中豐度為2.09×107，果肉下降至0.70×107，在種子顯著上調達19.08×107。積累量較高的代謝物多來自種子（有的屬種子特有），且多個被證實具有重要活性作用。如狹葉南五味子素 E、狹葉南五味子素 G對HIV-1有抑制活性[21]，日本南五味子木脂素G具有抗NO生成活性[22]，Kadusurain C對4種人腫瘤細胞（A549、HCT116、HL-60和HepG2）具有抗增殖作用[23]，日本南五味子木脂素 C對HepG-2人肝癌細胞具有較強的細胞毒活性，IC50值為9.92 μmol/L[24]。

表3 黑老虎果實不同部位（果肉、果皮、種子）木脂素成分及豐度Table 3 Abundance of lignans detected in in different parts(pulp, peel and seed) of Kadsura coccinea fruit

2.3.2 類黃酮 黃酮類化合物廣泛存在于自然界的植物中，是藥用植物的主要活性成分之一，具有多種生物活性和藥理作用，在藥物開發和食品保健領域有廣泛應用前景。在黑老虎果實中鑒定出類黃酮85個，果肉、果皮和種子分別含71個、85個和52個，3個部位共有51個。類黃酮在果皮中高度富集，豐度高達46.88×107，分別是果肉（6.29×107）和種子（0.29×107）的7倍和159倍。進一步將類黃酮分為查耳酮、二氫黃酮、黃酮醇、黃烷醇類、花青素、黃酮、黃酮醇、黃酮碳糖苷8個亞類（表4），其中，黃酮和黃酮醇數量超過其他6類之和。果肉和果皮中黃酮醇和花青素數量大幅度多于種子，這使得其類黃酮多樣性更豐富。而花青素、黃酮醇、黃酮、黃烷醇類在果皮中顯著向上積累，從而使果皮富含類黃酮；同時，由于它們在3個部位中富集不均衡，導致其黃酮類成分豐度呈現顯著差異。

表4 黑老虎果實不同部位（果肉、果皮、種子）類黃酮成分及豐度Table 4 Abundance of flavonoids detected in different parts(pulp, peel and seed) of Kadsura coccinea fruit

續表3

續表4

進一步發現，類黃酮在3個部位中豐度差異主要是受槲皮素、兒茶素和矢車菊素類成分的向上或向下積累影響。這些成分在果皮中高度富集，尤其槲皮素及衍生物積累量分別是果肉和種子的100和1000余倍。槲皮素、兒茶素雖然造成口感苦澀，但其有重要活性作用。據報道，槲皮素及衍生物具有優異的抗氧化特性，在神經系統疾病、炎癥、肝臟疾病、心血管疾病、細菌和真菌感染、抗癌等疾病中具有重要藥理作用[25-27]，對維持人體健康至關重要。兒茶素具有抗炎癥、抗菌、抗病毒及抗氧化等效用，還可預防心腦血管疾病，以及保護腎臟、肝臟和神經系統等[28-31]。表明，黑老虎果皮作為生物類黃酮原料，具有較高潛在利用價值。

2.3.3 萜類 黑老虎因含有結構多樣和新穎的三萜，從而廣受關注[7]。在果實中鑒定出的32個萜類化合物，含倍半萜、二萜、萜類、倍萜、三萜和三萜皂苷6個亞類，其中三萜數量最多（24個）。果皮（30個）和果肉（28個）中的數量遠高于種子（14個），主要因含有更多數量的三萜（表5）。同時，受三萜表達量下調的影響，萜類化合物在果皮（2.94×107）、果肉（1.80×107）、種子（1.31×107）中的豐度逐漸下降。鑒定出的萜類化合物中Kadcoccilactone A積累量最高，但僅種子中含有；其余富集較高的還有南五味子酸 D、Kadcoccitone C、Kadcotrione A等。此外，三個部位中都鑒定出Kadcoccilactone Q和Kadcoccilactone U，據報道這類結構新穎的三萜化合物只在黑老虎植物中發現過[32]。Liang等[33]報道kadcotrione A和具有抗HIV-1活性，EC50值為47.91 μg/mL；kadcoccitone B顯示出抗HIV活性，EC50值為30.29 μg/mL[34]；kadcoccinone C對6種人類癌癥細胞系（HL-60、SMMC7721、A-549、MCF-7、SW-480和Hela）具有細胞毒活性[35]。同樣表明黑老虎果實中萜類化合物具有明顯的研究和利用價值。

表5 黑老虎果實不同部位（果肉、果皮、種子）萜類成分及豐度Table 5 Abundance of terpenoids detected in different parts(pulp, peel and seed) of Kadsura coccinea fruit

3 結論

利用超高效色譜和串聯質譜技術在黑老虎果實中共檢測出307個次生代謝物，數量上以酚酸和黃酮類占主導。果皮、果肉和種子次生代謝物多樣性和豐度呈現出明顯差異，果肉和果皮中酚酸、類黃酮（黃酮醇和花青素）、三萜化合物（三萜）數量高于種子，從而使其多樣性優于種子。類黃酮（花青素、黃酮醇、黃酮、黃烷醇）在果皮中高度富集，生物堿上調，使其次生代謝物豐度遠高于果肉和種子。3個部位顯著差異代謝組分主要為酚酸和黃酮類化合物。

果皮中根皮素及衍生物、兒茶素及衍生物和花青素等類黃酮化合物高度富集，種子中則積累了較高的木脂素，這兩個部位都分別含有多個獨特成分；此外，果皮、果肉和種子中都鑒定出一些結構新穎的三萜化合物。這些高度富集和特有成分具有較高利用價值。由于次生代謝物受植物生長微環境及外界復雜環境等綜合影響，今后還需擴大測試樣本，如增加不同產地、不同種植模式和方式、不同樹齡等的比較分析，為黑老虎果實的開發和利用提供參考。