基于網絡藥理學探討山楂葉抗高脂血癥的作用機制及初步驗證

劉學貴，李知明，劉長風，周靜瑤，王瑤瑤，高品一, ，李丹琦

（1.沈陽化工大學功能分子研究所，遼寧沈陽 110142；2.硼鎂資源開發與精細化工技術國家地方聯合工程實驗室，遼寧沈陽 110142；3.沈陽化工大學制藥與生物工程學院，遼寧沈陽 110142；4.沈陽化工大學環境與安全工程學院，遼寧沈陽 110142；5.遼寧省綠色功能分子設計與開發重點實驗室，遼寧沈陽 110142）

高脂血癥（hyperlipidaemia，HLP）是由本身血脂代謝異常而引起的疾病，常表現為血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低或總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）升高[1]。高脂血癥不僅僅是肥胖和2型糖尿病等疾病的致病因素，還與高血壓、脂肪肝、動脈粥樣硬化等代謝型疾病密切相關[2]。目前，高脂血癥的治療藥物以西藥辛伐他汀、普伐他汀、非諾貝特、氯貝特等為主[3-4]，這類藥物具有明確效果，但靶點單一，長期使用常伴有副作用，如胃腸道不良反應、肝腎功能損害等，并且停藥后反彈幾率高[5]。因此，植源性藥物的研究成為人們關注的熱點[6]。相關研究發現許多天然產物中的黃酮類和皂苷類等化學成分能夠對肝臟脂質代謝系統進行調節，從而達到降血脂的目的[7]。

山楂（Crataegus pinnatifidaBunge），又名山里紅，薔薇科山楂屬，落葉喬木。山楂具有降血脂、血壓、強心、抗心律不齊等作用[8]。大多數山楂屬植物具有深綠色的葉子，白色的花和深紅色的果實[8]。山楂葉是山里紅的干葉，三角卵形或寬卵形，無毛，鋸齒在邊緣處，具有3～7片裂片，味澀，微苦[9-11]。山楂葉作為藥用植物有著悠久的歷史，其已用于癌癥、心血管疾病和糖尿病的治療[12-16]。刁婷婷等[17]以高脂血癥大鼠為研究對象，發現經過山楂葉總黃酮灌胃處理的大鼠肝臟組織中的（AMPK）表達增加，脂肪酸合成速度減緩，脂質代謝能力加強，并且脂肪變性程度有所減輕。肖峰等[18]研究發現，山楂葉總黃酮可以調節血脂水平，降低游離脂肪酸含量，進而起到抗炎抗氧化損傷的作用。

網絡藥理學是一個綜合性的概念，是在當前環境下將網絡生物學、化學生物學和系統生物學相互結合而衍生出來的一門新興學科。2007年英國科學家Hopkins為了研究多組分藥物之間的協同性和規律性，以尋找低毒性和高效性的藥物，提出了網絡藥理學這一概念[19]。網絡藥理學主要是通過網絡構建、網絡分析和實驗驗證的方式將網絡信號靶點和傳統實驗相結合，不但為尋找中藥和方劑的作用機制提供了新的方法，而且還可以加快藥物的研發進程[20]。本文運用網絡藥理學的方法，探究了山楂葉有效成分對高脂血癥疾病網絡的作用機制，進而預測出山楂葉中抗高脂血癥的良好化合物以及對應的靶點蛋白，為山楂葉中活性化合物的開發與利用提供支持。

1 材料方法

1.1 材料與儀器

葒草苷 阿拉丁生化科技股份有限公司；齊墩果酸、毛蕊花糖苷、蘆丁、牡荊素、4%多聚甲醛、油酸、異丙醇、阿托伐他丁 上海麥克林生化科技有限公司；牡荊素-2＂-O-鼠李糖 由作者課題組分離、純化和制備得到；ERK2激酶 日本Carna公司；Staurosporine（星形孢菌素） 美國Med Chem Express公司；DMSO、MgCl2、DTT、Triton X-100、Brij-35、ATP

美國Sigma公司；Peptide 8 島津GL公司；HEPES、EDTA、10%胎牛血清 澳洲Gibco公司；人體肝癌HepG2細胞株 上海富衡生物科技有限公司；MEM培養基、胰蛋白酶 美國Hyclone公司；油紅O染液、蘇木素染液、PBS緩沖液、甘油三酯（ TG ）試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒 南京建成科技有限公司；4% 組織細胞固定液 北京索萊寶科技有限公司。

CLM-170B-8-NF酶標儀、二氧化碳恒溫培養箱

美國Thermo公司；TS-1恒溫培養搖床 上海一恒科學儀器有限公司；AE31E倒置顯微鏡 美國Motic公司；BS 224 S電子分析天平 瑞士梅特勒托利多公司；HH-ZK2恒溫水浴鍋 鄭州予儀器制造有限公司；TGL-16醫用離心機 湘儀集團；LX-B35 L自動電熱壓力蒸汽滅菌器 華泰醫療設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 化合物的收集和結構處理 經過對山楂葉化學成分文獻的調研和本實驗組前期工作，共整理出116個以黃酮類化合物為主的化合物[21-27]，使用Chem Biodraw Ultra 14.0軟件繪制其化學結構，并以MOL2格式進行保存。

1.2.2 高脂血癥潛在靶點的收集 以“Hyperlipidemia”、“Hyperlipemia”、“High cholesterol”等為關鍵詞，利用GeneCards數據庫、Therapeutic Target Database、DrugBank以及Uniprot數據庫進行檢索，查找篩選出40個分辨率不高于3.0 ?且擁有原始配體的人源靶點蛋白。

1.2.3 “化合物-靶點”網絡的構建 利用Sybyl-X（version 2.0，Tripos，Inc.）對靶點蛋白進行修飾，將修飾好的蛋白和保存好的MOL2格式的化合物進行半柔性分子對接，將對接得分大于8的化合物和靶點蛋白共同導入Excel表格，利用Cytoscape v3.7.1軟件構建化合物-靶點蛋白網絡。

1.2.4 蛋白相互作用網絡的構建 將1.2.3得到的山楂葉活性成分和高脂血癥交集的靶點導入到STRING數據庫，群種定義為人類，最小交互閾值設置為0.4，其他參數默認。將得到的結果導入Cytoscape v3.7.1軟件中，生成PPI網絡。

1.2.5 GO生物過程和KEGG信號通路富集分析

將需要分析的基因提交到DAVID平臺中，選定人的全基因作為背景，對疾病的相關靶點進行GO和KEGG富集分析，得到生物過程、細胞成分、分子功能和關鍵信號通路的富集信息，利用R軟件對富集P值小于0.05的功能進一步分析。

1.2.6 “化合物-靶點-信號通路”構建 將化合物、信號通路和靶點之間的聯系利用Cytoscape v3.7.1軟件建立，即構建化合物-靶點-信號通路網絡以識別他們之間的關系。網絡特征分析由軟件中的“network analyzer”程序完成以此來初步得出化合物與靶點蛋白之間的作用情況和靶點蛋白在相關通路之間的聯系。

1.2.7 ERK2激酶抑制活性實驗 絲裂原活化蛋白激酶MAPK，是一組高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基端激酶（JNK）、p38MAPK、ERK5[28]，MAPK的激活是脂肪形成的重要組成部分[29]。ERK是MAPK主要的通路之一，位于MAPK通路的下游，MAPK的所有突變和擴增最終都會導致ERK的異常激活[30-31]。細胞中脂滴的形成依賴于ERK2的激活，抑制ERK2能顯著降低VLDL脂解后的脂滴積累[32]。同時，一些體內實驗表明一些促脂肪劑抑制MEK/ERK活性可以阻止脂肪細胞的生成，降低體內整體血脂水平以治療高脂血癥[33]。因此，抑制ERK2被認為是治療高脂血癥的潛在途徑。

本文以ERK2為靶酶，STS（星形孢菌素）為陽性對照藥，基于網絡藥理學的預測結果，結合實驗組前期從山楂葉中分離得到的代表性和量大的化合物，選取6個（牡荊素、齊墩果酸、毛蕊花糖苷、蘆丁、葒草苷、牡荊素-2-O鼠李糖苷）委托上海睿智化學研究有限公司采用遷移率改變法[34]進行活性驗證實驗：

制備激酶液（50 mmol/L HEPES，pH7.5，0.01%Triton X-100）和停止液（100 mmol/L HEPES，pH7.5，0.015% Brij-35，0.2 % 涂層試劑 #3，50 mmol/L EDTA）。

將待測化合物在DMSO中制備成10 mmol/L的儲備液。隨后再用DMSO稀釋至5000 μmol/L。取100 μL，添加到96孔板中。利用梯度稀釋的方法將化合物配制成100、10 μmol/L和1 μmol/L的稀釋液。

取5 μL的稀釋液加入到混合有10 μL DMSO和90 μL的1×激酶緩沖液的檢測板中。在1×激酶基緩沖液中加入激酶，配成2.5×酶溶液。在檢測板上每孔加入10 μL 2.5×酶液，在室溫條件下孵育10 min。孵育完成后向每個孔中加入10 μL的2.5×肽溶液（在1×激酶緩沖液中含有FAM標記的肽、ATP以及MgCl2的肽溶液）以開始反應，并在28 ℃的環境中孵育30 min。加入25 μL停止液，反應結束。

使用EZ ReaderⅡ（Caliper Life Sciences，Waltham，MA，USA）（下游電壓-500 V，上游電壓-2250V，基礎壓力-0.5 PSI，屏幕壓力-1.2 PSI）對所有樣品進行分析，以讀取轉換值，抑制率百分比如式1所示。

注：max代表DMSO對照的轉換值；min代表無酶對照的轉換值；conversion代表給定化合物劑量下的轉換值。

1.2.8 分子對接 本文利用Auto Dock vina 1.1.2軟件基于ubuntu 20.04系統進行對接。蛋白被設定一個分子口袋后，小分子以半柔性對接的方式與其對接。對接完成后對小分子和蛋白之間的結合能力進行打分。根據得分高低判斷其相互作用力。

本文將陽性對照藥（STS）、牡荊素、齊墩果酸、蘆丁、葒草苷、牡荊素-2 O鼠李糖苷和毛蕊花糖苷分別與ERK2（4QTA）對接。

1.2.9 高脂HepG2細胞模型建立與甘油三酯含量測定 作為檢測組織內油脂的常用試劑，油紅O能夠使脂肪組織及細胞內的脂滴著色[35]，而被廣泛用于臨床和科研病理的工作中[36]。本文采用油紅O對油酸處理的HepG2細胞進行染色。HepG2細胞用含10% 胎牛血清的培養液培養，并在培育箱中孵育。待生長密度達80%～90%時吸取2 mL的細胞接種于六孔板內（約15萬個/孔），置于37 ℃，5%的CO2條件下培養24 h，設置空白組、油酸模型組和藥物處理組，如表1所示。

表1 細胞加藥方法Table 1 Operation method of cell administration

將六孔板中的培養液吸出，用PBS和60%異丙醇分別將細胞漂洗兩次，避光條件下加入1 mL油紅O染液，在37 ℃恒溫箱下保持15 min，用60%異丙醇和蒸餾水分別進行漂洗，之后加入0.5 mL蘇木素，復染30 s。用顯微鏡觀察，采集清晰圖像，并用100%異丙醇提取染色脂滴，在490 nm處測定其吸光度。

有研究發現，阿托伐他汀（ATS，一類降低人體內膽固醇水平的藥物）可以有效降低體內的血脂水平[37]達到降血脂的目的。本文為檢驗牡荊素對脂質的抑制作用效果，在油酸存在的情況下，用100 μmol/L阿托伐他汀處理油酸組HepG2細胞作為陽性對照組，然后用油紅O進行染色，在顯微鏡下觀察，并在490 nm處測定其吸光度。另取一塊培養條件相同的六孔板去除其上的培養液，用胰蛋白酶對細胞進行消化。然后在室溫條件下，將細胞懸液放入離心機，以1000 r/min離心10 min，去除上清液，將0.5～1 mL的PBS加入進細胞沉淀中混勻，重復操作1～2次，并在冰上加入裂解液進行裂解。裂解后按照說明書操作TG試劑盒，用酶標儀檢測波長510 nm處的吸光度，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，計算甘油三酯含量（如式2所示）。

2 結果與分析

2.1 有效成分-作用靶點網絡圖分析

圖 1 化合物-靶蛋白網絡圖Fig.1 Network of compound-target protein

通過網絡藥理學分析山楂葉中116個活性成分和40種高脂血癥相關蛋白靶點的相互作用，分析結果表明山楂葉中有93種化合物分別與這40種高脂血癥的蛋白可以相互結合。將對接得分大于8的化合物與蛋白匯總到Excel表格中并導入Cytoscape v3.7.1中（如圖1所示）。整個網絡以網絡拓撲結構表示，其中正方形代表高血脂的靶點蛋白，圓形代表山楂葉中的活性化合物。通過Network Analysis分析，結果如下：該網絡由133個節點和441條邊組成，網絡異構性為1.167，網絡密度為0.050，網絡的半徑和直徑分別為4和6，網絡中心度為0.349，特征路徑長度為2.793，相鄰平均數目為6.632。其中，Erythro-1-（4-O-β-D-Glucopyranosyl-3-methoxyphenyl）-2-[4-（3-hydroxypropyl）-2,6-dimethoxyphenoxy]-1,3-propanediol（112）、Verbascoside（111）、（7S, 8R）-5-Methoxydihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-Dglucopyranoside（113）、Acernikol-4''-O-β-D-glucopyranoside（107）、（2,3-Dihydro-2-（4-O-β-D-glueopyranosyl-3-methoxy-Phenyl）-3-hydroxymethyl-5-（3-hy droxypropyl）-7-methoxybenzofuran）（108）、Rutin（1）等為山楂葉抗高脂血癥的潛在化合物，靶點蛋白3V99（Arachidonate 5-lipoxygenase）、3WEG（Squalene synthase）、3E7G（Nitric-oxide synthase inducible）、1N5U（Serum albumin）、6A93（Hydroxytryptamine receptor 2A）、4QTA（Mitogen-activated protein kinase 1）、3CCZ（HMG-CoA reductase）、3TJM（Fatty acid synthase）等為治療高脂血癥的關鍵靶點蛋白。

2.2 PPI網絡結果分析

將分子對接得到的40個潛在基因靶點導入到STRING數據庫中以構建PPI網絡，用Cytoscape v3.7.1進行可視化處理（如圖2所示）。由圖2可知，該網絡平均節點度為13.2，平均局部聚類系數為0.791。圖中共計包含40個節點，263條邊。節點的顏色及大小和高脂血癥蛋白靶點的度成正相關，在PPI網絡中顏色越深代表他們之間的相互作用關系越強。從圖2可以看出，PPARG、GAPDH、ALB、AKT1、INS直至MAPK1等節點顏色深且較大，說明這些靶點可能在高血脂癥的發展中起關鍵作用。

圖 2 蛋白相互作用（PPI）網絡圖Fig.2 Network of protein-protein interaction

2.3 GO和KEGG富集分析

將40個基因導入DAVID數據庫進行GO生物富集和KEGG信號通路富集分析。GO分析結果表明與生物過程（BP）有關的項目為163個，與分子功能（MF）相關的項目為48個，與細胞成分（CC）相關的項目為30個。挑選出前15個繪制條形圖（如圖3所示）。多靶點在BP中對膽固醇生物合成過程、脂質代謝過程、脂蛋白代謝過程、類固醇激素介導的信號通路、膽固醇體內平衡等有較大影響；在CC中對小腔影響較為突出，對高爾基體、胞質、細胞外空隙、核漿等都有影響；在MF中對藥物結合、類固醇激素受體活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性和配體活化序列特異性DNA結合、酶結合、一致的蛋白質結合等均有重要影響。

在KEGG富集分析中將前20個有明顯統計學意義的通路（P＜0.01）繪制成氣泡圖（如圖4所示）。在氣泡圖中，氣泡越大代表著所在通路富集的基因越多，同時氣泡顏色越深代表基因靶點在此通路上的富集程度越高。由圖4可知，與高脂血癥較為密切的靶點信號通路主要涉及代謝通路、AMPK信號通路、HIF-1信號通路、胰島素抵抗、甲狀腺激素信號通路、PPAR信號通路、卵巢類固醇生成。

脂質代謝是細胞將營養物質轉化為能量的關鍵過程，是膜生物發生和信號分子產生的基礎。在代謝活躍的細胞中，來自線粒體的活性氧過量，細胞外介質作用和細胞內應激都可以啟動炎癥通路從而啟動炎癥。Song 等[38]研究發現黑米花色苷能通過調節肥胖小鼠脂代謝和腸道菌群緩解高脂血癥、肝臟脂肪變性和胰島素抵抗。缺氧誘導因子（HIF）是細胞適應缺氧的主要轉錄因子，普遍存在于哺乳動物的細胞內，一般情況下會被細胞內的酶迅速降解，只有在缺氧的情況下才可穩定表達。研究發現缺氧誘導因子的上調能夠增強高脂大鼠缺血后的心臟保護作用[39]。絲裂原活化蛋白激酶（AMPK），即AMP依賴的蛋白激酶，其在各種與代謝相關的器官中均有表達，并且能被機體以各種方式刺激激活。藥理學和遺傳學研究表明，AMPK能使機體內的葡萄糖維持一個相對穩定的平衡。孫樂[40]研究發現粗壯女貞總苷能夠通過促進肝臟中LKB1磷酸化來激活AMPK調節代謝，降低高脂金黃地鼠血脂水平。綜上，山楂葉中活性成分可能是通過以上通路為主其他多信號通路相互協調發揮抗高血脂癥的效用。

2.4 化合物-靶點-信號通路網絡分析

如圖5所示，在化合物-靶點-信號通路網絡分析中圓形代表山楂葉中化學成分，菱形代表高血脂相關靶點，箭頭代表KEGG富集篩選出的信號通路。該網絡根據鏈接值排序，鏈接值越大，節點面積越大、顏色越深，該網絡包括153個節點、1747條邊、20個箭頭型節點代表的信號通路和40個菱形節點代表的高脂血癥靶蛋白以及93個圓形節點代表的山楂葉化學成分，該網絡半徑和直徑分別為3和4，多邊緣節點對為263，相鄰平均條目為17.294，特征路徑長度為2.134，異構性為0.915，中心度為0.585，網絡密度為0.114，聚類系數為0.260。由圖5可知：化合物112（erythro-1-（4-O-β-D-glucopyranosyl-3-methoxyphenyl）-2-[4- （3-hydroxypropyl）-2,6-dimethoxyphenoxy]-1,3-propanediol）、111（verbascoside）、108（（2,3-Dihydro-2-（4-O-β-D-glueopyranosyl-3-methoxy-Phenyl）-3-hydroxymethyl-5-（3-hydroxypropyl）-7-methoxybenzofuran））、107（acernikol-4''-O-β-Dglucopyranoside）、95（norhawthornoid A）、113（（7S,8R）-5-methoxydihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside）、110（（7S,8R）-urolignoside）、1（rutin）、115（（+）-lariciresinol-4-O-β-D-glucopyranoside）、63（linarionoside B）等在整個網絡中起重要的調控作用。有可能抗高血脂的關鍵靶點為ALOX5、FDFT1、MAPK1、NOS2、CYP7A1、ALB、HTR2A、SLC2A1、HMGCR、FASN，關鍵信號通路為Metabolic pathways、Pathways in cancer、Toxoplasmosis、HIF-1 signaling pathway、Ovarian steroidogenesis、PPAR signaling pathway、AMPK signaling pathway、Thyroid hormone signaling pathway、Insulin signaling pathway、Serotonergic synapse等。

圖 3 靶蛋白的GO富集分析圖Fig.3 GO enrichment analysis of target proteins

圖 4 高脂血癥相關潛在靶點的KEGG分析圖Fig.4 KEGG analysis of potential targets related to hyperlipidaemia

圖 5 化合物-靶點-信號通路網絡圖Fig.5 Network of compound-target-signal pathway

2.5 激酶驗證試驗結果

激酶實驗結果如表2和圖6所示。由表2和圖6可知，樣品濃度和抑制率呈正相關關系。當化合物測試濃度為100 μmol/L時，牡荊素對ERK2抑制率最高為84%，牡荊素-2"-O-鼠李糖抑制率最弱，抑制率僅為3%。陽性對照藥IC50值為0.470 μmol/L，牡荊素IC50值為20.422 μmol/L，其值雖高于陽性對照藥，但其仍表現出對ERK2激酶較好的抑制活性。所以，可以認為牡荊素通過對ERK2的抑制以達到降血脂的目的。牡荊素是山楂葉中含量較高的代表性化合物，有報道稱其含量可達到31.39%[41]，由此，表明在山楂葉抗高脂血癥的過程中，牡荊素可能通過與高脂血癥的關鍵靶蛋白相互作用以達到降血脂的目的。

表2 化合物酶抑制活性測試結果Table 2 Test results of enzyme inhibitory activity of the compounds

圖 6 化合物的ERK2激酶抑制活性Fig.6 Inhibitory ERK2 kinase activity of the compounds

2.6 分子對接模式驗證

本文利用分子對接模式來驗證六種化合物和陽性對照藥（STS）與靶點蛋白的結合能。分子對接的結合能越低，說明配體與受體之間相互作用的可能就越大；一般情況下，當結合能小于-5 kcal/mol時代表兩者之間具有良好的結合性[42]。將陽性對照藥（STS）、牡荊素、齊墩果酸、蘆丁、葒草苷、牡荊素-2 O鼠李糖苷和毛蕊花糖苷分別與ERK2（4QTA）對接，結合能分別為：-9.8、-9.6、-9.4、-8.8、-4.6、-3.9和-3.1 kcal/mol。將對接結果小于-5 kcal/mol的化合物進行分析，STS與ERK2的GLU-33、LYS-54、TYR-36等殘基結合（如圖7A）；牡荊素與LYS-54、SER-153、TYR-36等殘基結合（如圖7D）；齊墩果酸與SER-153、LYS-151、TYR-36等殘基結合（如圖7B）；蘆丁為與LYS-151、SER-153、LYS-54和TYR-36相互結合（如圖7C）。

對接結果表明，在實驗組中牡荊素與ERK2的結合能最低，所得實驗結果與激酶實驗測定的活性結果相一致。從另一角度驗證了激酶活性實驗結果的準確性。并且從對接結果可以推測，殘基LYS-54和TYR-36可是抑制ERK2激酶活性的主要殘基。

2.7 油紅O染色及定量試驗結果

將處理后的細胞用油紅O進行染色，在顯微鏡下觀察，脂滴顯示為鮮紅色。并在490 nm處測定其吸光度。實驗結果表明，濃度為100 μmol/L的阿托伐他汀可減少12.2%的脂滴堆積；分別加入100、50 μmol/L和25 μmol/L的牡荊素后，脂滴聚集分別減少5.4%、2.2%和2.1%，說明牡荊素對脂滴的聚集有一定的抑制作用，且隨著濃度增大，抑制作用逐漸增強如圖8和圖9所示。

圖 7 結合能最低的分子對接模式Fig.7 Docking mode with lowest binding energies

圖 8 油紅O染色圖Fig.8 Oil red O staining chart

圖 9 油紅O染色定量分析結果Fig.9 Quantitative analysis results of oil red O staining

2.8 甘油三酯（TG）含量測試結果

牡荊素對高脂HepG2細胞甘油三酯含量的影響如表3所示。與空白組相比較，油酸模型組內的TG含量明顯增加。當牡荊素濃度為25、50 μmol/L和100 μmol/L時，其處理的細胞的TG含量相比于模型組都有一定程度的降低，并且呈現濃度依賴，濃度為100 μmol/L的效果最好。因此，牡荊素有望作為一種降低細胞內血脂含量的潛在治療化合物。

表3 牡荊素對高脂HepG2細胞甘油三酯含量的影響Table 3 Effect of vitexin on triglyceride content in high-fat HepG2 cells

3 結論

本文基于網絡藥理學的方法對山楂葉所含有的化合物進行了活性篩選、靶點分析和相關靶點通路預測，篩選得到93個活性化合物和40個潛在的高脂血癥靶點蛋白以及20個相關靶蛋白的信號通路。在ERK2激酶活性驗證實驗中，以STS為陽性對照藥，齊墩果酸、葒草苷、毛蕊花糖苷、蘆丁、牡荊素、牡荊素-2＂-O-鼠李糖為待測化合物。上述化合物對激酶都有一定的抑制活性，牡荊素效果最好，其抑制率達到84%，IC50值為20.422 μmol/L。通過分子對接模式，以結合能為指標對激酶結果進行驗證，結果表明牡荊素與ERK2蛋白的LYS-54、SER-153、TYR-36等殘基能相互結合，結合能最低為-9.6 kcal/mol，與激酶實驗結果一致。以HepG2細胞建立高脂血癥模型，阿托伐他汀為陽性對照藥，當濃度為100 μmol/L時，牡荊素脂滴減少了5.4%，說明牡荊素對脂滴的聚集有一定的抑制作用，且隨著濃度增大，其抑制作用逐漸增強。甘油三酯試劑盒測定實驗中，甘油三酯含量隨著牡荊素增加而減少。以上實驗結果證實了網絡藥理學預測山楂葉中牡荊素對高脂血癥具有較好抑制作用。