羅格列酮對急性胰腺炎大鼠肺組織HMGB1和JAK2/STAT3信號通路調控的研究

陸貝　王京瑞　殷俊杰　蔡陽　徐孫兵

[摘要] 目的 探討羅格列酮對SAP模型大鼠早期炎癥介質、晚期炎癥因子HMGB1和JAK2/STAT3信號通路表達的調控。方法 72只SD大鼠隨機分為3組，假手術組（SO組，n=24）、胰腺炎模型組（SAP組，n=24）和羅格列酮組（ROSI組，n=24）。SAP組在麻醉后兩次腹腔內注射左旋精氨酸，ROSI組在SAP建模后30 min靜脈注射羅格列酮針6 mg/kg，SO組在麻醉后腹腔注射等體積生理鹽水。3組術后6 、12和24 h分別采樣（每個時間點n=8），測定血清TNF-α、IL-1β、IL-6等早期炎癥因子含量，觀察大鼠肺組織病理改變，測定肺髓過氧化物酶和肺干/濕重比，檢測肺組織HMGB1、JAK2、STAT3蛋白表達情況。 結果 ROSI組大鼠的血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量較SAP組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）;與SAP組比較，ROSI組的肺組織病理損傷減輕，肺MPO表達降低，干/濕重比下降，HMGB1、JAK2、STAT3蛋白表達明顯減低，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 羅格列酮能抑制肺組織JAK2、STAT3表達，降低早期、晚期炎癥因子表達，減輕SAP導致的肺損傷。

[關鍵詞] 胰腺炎;肺損傷;炎癥因子;信號通路

[中圖分類號] R364.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）14-0020-05

Research on the regulation of rosiglitazone on signaling pathways of HMGB1 and JAK2/STAT3 in pulmonary tissue of rats with acute pancreatitis

LU Bei? ?WANG Jingrui? ?YIN Junjie? ?CAI Yang? ?XU Sunbing

Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery， Affiliated Hangzhou First People′s Hospital， Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou 310006， China

[Abstract] Objective To investigate the expression regulation of rosiglitazone on signaling pathways of HMGB1 and JAK2/STAT3 in early inflammatory mediators， late inflammatory factors of rats with SAP model. Methods A total of 72 SD rats were randomly divided into the sham operation group （SO， n=24）， the pancreatitis model group （SAP， n=24） and the rosiglitazone group （ROSI， n=24）. The SAP group was injected with L-arginine intraperitoneally twice after anesthesia， the ROSI group was injected with rosiglitazone by 6mg/kg intravenously 30 minutes after SAP modeling， and the SO group was injected with the same volume of normal saline intraperitoneally after anesthesia. Samples were taken at 6 hours， 12 hours and 24 hours after operation in three groups （n=8， at each time point）. The contents of early inflammatory factors such as TNF-α， IL-1β， IL-6 in serum were detected. The pathological changes of rat pulmonary tissue were observed， the pulmonary myeloperoxidase and the pulmonary dry/wet weight ratio were detected， and the expression of HMGB1， JAK2 and STAT3 protein in pulmonary tissue were detected. Results The levels of serum IL-1β， IL-6 and TNF-α in the ROSI group were remarkably lower than those in the SAP group， with statistically significant differences （P<0.05）. Compared with the SAP group， in the ROSI group， the pathological injury of pulmonary tissue was alleviated， MPO expression in lung was decreased， dry/wet weight ratio was lowered， and HMGB1， JAK2， STAT3 protein expression were remarkably reduced， with statistically significant differences （P<0.05）. Conclusion Rosiglitazone can inhibit the expression of JAK2 and STAT3 in pulmonary tissue， reduce the expression of early and late inflammatory factors， and alleviate pulmonary injury caused by SAP.9662AB48-F1CC-4F9C-AD31-4A74CA88EAAC

[Key words] Pancreatitis; Pulmonary injury; Inflammatory factors; Signaling pathway

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）引發的多器官功能不全（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）之一，嚴重者可發生呼吸衰竭甚至死亡，其發病率及病死率高達50%和60%[1-4]。全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）是MODS和ALI已知的重要發病機制之一，多種信號通路誘發早期、晚期炎癥因子級聯釋放效應已得到公認。Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子（Janus activated kinase / signal transducer and activator of transcriptions，JAK/STAT）信號通路是近年發現的一條細胞內信號轉導途徑，涉及細胞因子調控，細胞免疫調節及增殖、分化、凋亡等過程。本研究使用炎癥反應調節劑——過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferators-activated receptor-γ，PPAR-γ）激動劑羅格列酮來觀察其對SAP大鼠肺損傷的保護作用，并探討JAK2/STAT3信號通路可能的調節機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

72 只成年雄性清潔級SD大鼠，體重255～315 g，浙江中醫藥大學動物實驗中心提供（SYVK浙2018-0012）。戊巴比妥鈉針劑、二甲基亞砜（DMSO）、L-精氨酸（L-arginine）購自Sigma公司（Sigma，USA）;羅格列酮（rosiglitazone）購自Cayman公司（Cayman，USA）;Janus激酶2（JAK2）、信號轉導與轉錄激活子3（STAT3）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等ELISA試劑盒購自R&D公司（R&D，USA）。本研究通過浙江大學醫學院附屬杭州市第一人民醫院醫學倫理委員會審批（批號：17258）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組? 大鼠術前禁食12 h，隨機分為模型組（SAP組，n=24）、羅格列酮組（ROSI組，n=24）、假手術組（SO組，n=24）。每組制模后6 h（n=8）、12 h（n=8）和24 h（n=8）剖殺，采樣檢測。

1.2.2 模型制備? 麻醉方法：腹腔內注射2.5%戊巴比妥鈉，劑量0.2 ml/100 g;麻醉后向大鼠腹腔內先后兩次注射濃度為20 g/L的L-精氨酸2.0 g/kg，間隔1 h，完成SAP制模，股靜脈插管備用。ROSI組SAP制模成功后，經股靜脈插管一次性注射10%DMSO溶解的羅格列酮溶液6 mg/kg;SO組麻醉后僅向腹腔內注射等體積0.9%NS。

1.3 觀察指標與評價標準

1.3.1 血清炎癥細胞因子檢測? 血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白細胞介素-1β（interieukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interieukin-6，IL-6）的含量采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測，具體操作參照ELISA檢測試劑盒說明書。

1.3.2 肺組織形態學變化? 大鼠相應觀察時間點剖殺后以4%多聚甲醛固定右肺前葉組織，石蠟包埋，浸泡、染色、分色、脫水、透明、固定、封片后光鏡下觀察。

1.3.3 肺組織JAK2、STAT3、HMGB1、MPO檢測? 取右肺中葉適量組織，制成組織勻漿后離心取上清備用，用雙抗體夾心法檢測JAK2、STAT3、HMGB1、MPO的表達，具體操作參照ELISA檢測試劑盒說明書。

1.3.4 肺含水量（干/濕重比）? 濾紙吸干左肺葉表面液體，去除脂肪，稱量濕重。80℃烤箱干燥48 h，稱量干重，計算肺組織干/濕重比。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0統計學軟件進行數據分析，計量資料符合正態分布以均數±標準差（x±s）表示，組間比較用ANOVA方差分析，組內比較用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清炎癥因子水平比較

SAP組及ROSI組血清炎癥細胞因子TNF-α，IL-1β、IL-6隨時間延長而升高，兩組各時間點的血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于SO組，差異有統計學意義（P<0.05）。ROSI組6、12、24 h各指標水平均低于SAP模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組肺組織病理改變比較

SO組大鼠肺組織大體無明顯異常，SAP組大鼠大體可見肺組織明顯點狀出血，ROSI組變化介于兩者之間。鏡下SO組大鼠肺泡及間質結構正常（封三圖2A）;SAP組可見大量炎癥細胞浸潤，肺泡腔出血、滲出，間隔增寬，部分肺泡破裂、塌陷或不張（封三圖2B）。ROSI組各時間點炎癥細胞浸潤、滲出、肺泡損傷程度較SAP組不同程度減輕（封三圖2C）。

2.3 各組肺JAK2、STAT3蛋白表達比較

SAP組、ROSI組造模后3個時間點肺泡上皮細胞JAK2、STAT3蛋白表達較SO組升高（P<0.05）。ROSI組12、24 h的JAK2表達，6、12、24 h的STAT3表達均低于SAP模型組（P<0.05）。見表2。9662AB48-F1CC-4F9C-AD31-4A74CA88EAAC

2.4 各組肺內晚期炎癥介質HMGB1表達比較

SAP組、ROSI組SD大鼠肺腎組織HMGB1的表達隨時間延長而增加，SAP組及ROSI組各時間點HMGB1的表達均高于SO組，差異有統計學意義（P<0.05）。ROSI組6、12、24 h肺HMGB1表達均低于SAP組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3、圖2。

2.5 各組肺髓過氧化物酶活性比較

SAP組、ROSI組肺組織MPO活性較SO組明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。ROSI組6、12、24 h肺MPO活性低于SAP組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4、圖3。

2.6 各組肺干/濕重比（含水量）

SAP組、ROSI組肺臟干/濕重高于SO組，差異有統計學意義（P<0.05），ROSI組12、24 h肺干/濕重比低于SAP組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表5、圖4。

3 討論

SAP早期肺損傷主要由全身過度炎癥反應引起，具體機制比較復雜，可能與中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞[3-5]等有關，或與TNF-α，IL等炎癥因子、血小板活化因子、核因子-κB等相關，抑或有互相協同機制。細胞因子之間不僅存在密切的相互作用，同時也可與信號傳導通路相互作用影響疾病進程，且一旦被激活，將發生不斷放大的瀑布效應[3]。現已發現多種細胞因子與JAK/STAT信號通路相互作用，其中JAK2和STAT3在胰腺腺泡細胞中均發現有特異性抗體。JAK/STAT3通路可由炎癥因子活化、傳導完成信號轉導過程，并通常在炎癥反應早期發揮作用[6-11]。JAK通過細胞因子誘導，形成活化的p-STAT3，將信號傳導至細胞核內調節基因表達。STAT3廣泛表達于多種組織和細胞，STAT3信號通路的異常激活可引起細胞功能失調，誘發細胞凋亡、免疫反應和炎癥反應等過程。不少研究已證實STAT3的激活見于誤吸、急性胰腺炎、休克復蘇等損傷模型。SAP并發肺損傷時，IL-6、IL-1β等早期炎癥因子的變化趨勢與JAK2和STAT3蛋白表達呈正比[7]，且STAT3激活早于肺損傷的發生，推測JAK2/STAT3信號通路在肺損傷早期發揮重要作用。TNF-α、IL-1β、IL-6等早期炎癥因子通過JAK/STAT信號通路介導進一步激活晚期炎癥因子HMGB1等，在炎癥進展過程中發揮作用。在感染性疾病中，高遷移率族蛋白B1是首個被證實的晚期炎癥反應介質。研究表明當機體暴露于內毒素后，血清中高遷移率族蛋白B1在24 h以后才明顯升高，而延遲應用HMGB1的中和性抗體可減輕內毒素相關性損傷。在胰腺炎動物模型的血清中同樣能檢出HMGB1，并可能作為早期炎癥反應因子的下游因子參與全身炎癥反應活動，與胰腺炎病情的加重有關。

本研究結果顯示，SAP組大鼠在造模6 h后肺組織有明顯的急性損傷改變，肺組織JAK2、STAT3表達升高，血清IL-1β、IL-6、TNF-α升高，肺晚期炎癥因子HMGB1表達增多，肺MPO活性升高，肺含水量增加，且炎癥指標及損傷程度基本隨時間延長遞增，于12、24 h達到峰值后回落，與已有的研究結果較一致，表明早期、晚期炎癥因子的上調與JAK2、STAT3蛋白表達同步，兩者可能存在受調節關系。ROSI組大鼠肺病理損傷較SAP組減輕，12、24 h肺組織JAK2 6、12、24 h肺組織STAT3蛋白，6、12、24 h肺組織MPO活性和肺含水量下降，6、12、24 h早期、晚期炎癥因子均較SAP組減低，且部分指標24 h與12 h比較，差異有統計學意義（P<0.05），提示羅格列酮對JAK2/STAT3信號通路和炎癥因子有明確的抑制作用，對SAP肺損傷有保護作用。

活化的PPAR-γ在炎癥、損傷和休克模型中具有抗炎作用，其中羅格列酮具有高選擇性[12-20]。本研究中羅格列酮對JAK2/STAT3信號通路，早期、晚期炎癥因子具有同步調控作用，雖不能確定兩者的上下游關系及量效關系，但借鑒以往的研究推測羅格列酮通過JAK2/STAT3信號通路下調炎癥反應，保護SAP導致的肺損傷，為今后進一步研究提供基礎。

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（收稿日期：2021-07-30）9662AB48-F1CC-4F9C-AD31-4A74CA88EAAC