TOMM40 基因多態性及基因- 環境交互作用對血管性癡呆的影響

馬玥 ，張鵬 ，盧杉

1.黑龍江省醫院神經內二科，黑龍江哈爾濱 150000；2.黑龍江省醫院老年神經內科，黑龍江哈爾濱 150000；3.黑龍江省醫院醫學影像科，黑龍江哈爾濱 150000

阿爾茨海默病是世界排名第一的癡呆類型疾病，血管性癡呆（vascular dementia, VD）是世界排名第二大癡呆類型的疾病， 腦血管因素引發的腦部組織損害造成的癡呆綜合征是該病的主要發病原因，分類型為缺血性腦血管疾病、 急慢性缺氧腦血管疾病和出血性腦血管疾病， 約占老年認知障礙病因的20%,其臨床表現為認知功能減退、記憶障礙、情感障礙、行為異常、 生活自理能力及其他社會功能下降，嚴重影響患者的生存質量[1-3]。 血管性癡呆受多因素影響，認為其與基因、環境、基因-環境共同作用發生。 在研究VD 疾病發病因素時，如果單純考慮遺傳因素或環境因素單一因素對疾病病因的相關性，忽略基因-環境兩因素的交互作用，會對病因的風險評估出現誤差[4-6]。該研究選擇2020 年6 月—2021 年6月門診及住院治療的100 例VD 患者入組， 對照組選取沒有認知功能障礙的老年人100 名入組， 探索基因、 周圍環境和基因-環境之間的交互作用機制，以此來更好地解釋血管性癡呆疾病的發生發展過程，進行更為有效的預防VD 發生的風險預測，對該病具有重大的指導意義。 現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取門診及住院治療的100 例VD 患者為病例組， 同時選取無認知功能障礙的健康老年人100 名作為隨機對照組。研究對象患者簽訂知情同意書，采用簡易智能狀態檢測量表（MMSE）和蒙特利爾認知評估量表（MoCA）兩個量表檢測評估[7]，評分測試由該院專科醫師完成，避免出現偏倚。參與患者均了解該次研究的目的， 均自愿參加并該次研究方法和內容經過醫院倫理委員批準。

病例組納入標準： 均符合瑞士日內瓦國際神經科學研究協會和美國國立衛生院兩個權威機構制定的血管性癡呆疾病的診斷標準； 顱腦CT、MRI 影像檢查證實腦內有多發腔隙性梗死或梗死灶或缺血性廣泛性白質損害， 并且梗死灶區域對應神經系統癥狀、神經體征與血管性癡呆患病因素有必然因果性；患者及家屬對該研究具體內容有知情權并簽署知情同意書[8]。排除標準： 患有嚴重心、腎、肝等器質性病變或其他惡性病變者；嚴重焦慮、躁狂、抑郁癥等心理疾病者；嚴重意識障礙，表達不清者[9]。

1.2 方法

1.2.1 問卷調查 設計環境流行病學調查表對受試者完成問卷調查答卷，調查表內容包括人口基本資料，研究組 100 例，男 64 例，女 36 例；年齡 45~76 歲，平均（60.82±11.65）歲。 患者自愿并同意在醫生指導下按要求填寫調查問卷表； 采用匿名調查問卷收集資料，并遵循保密原則。 問卷包括癡呆的嚴重程度、血管相關危險因素和個人生活飲食習慣、 氣候氣溫氣壓等方面。

1.2.2 基因多態性檢測 全血標本采集：所有患者清晨空腹未進食水， 采用枸櫞酸鉀抗凝管抽取靜脈血5 mL， 目的是防止抽取的血液凝固和出現溶血現象影響結果，于-8℃冰箱冷凍保存，標本收集完成后，提取DNA，儲存于低溫下備用。

1.2.3 PCR 擴增 根據美國國立生物技術信息中心（NCBI）提供的 TOMM40 基因序列，PCR 設計TOMM40基因引物：正向引物：5’-AGGAAGAGATGAGAGTTGGTGTG-3’，反向引物 ：5’-CTGGAGAAGAGAAACGCTGTC-3’。根據熔解曲線圖挑選出不同基因型的樣本進行PCR 擴增，并由上海生工生物工程股份有限公司合成基因。

1.2.4 溫度及循環設置 PCR 反應條件 95℃預變性10 min 后進入主循環，95℃變性 30 s，60℃退火 30 s,72℃延伸60 s，共兩個循環，退火溫度每兩個循環下降 2℃直至 55℃，95℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸60 s，共40 個循環。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳法 將盛有20 mL TAE 的錐形瓶中加入0.3 g 瓊脂糖，酒精燈加熱1 min。等待液體變涼， 加入 2 μl EB 或 4 μl 核酸染料至錐形瓶中。 制膠板放入制膠電泳槽中，插入梳子。 將溶解的瓊脂糖倒入其中至4~6 mm。 消除氣泡。 室溫下冷卻至凝固。垂直拔出梳子避免空樣完好無損。將膠版放入電泳槽內， 取 5 μl PCR 擴增產物加入 1 μl DNA loading，合計 7 μl。 將其加入樣孔中。 使用 2000TM DNA Marker 5 μl 作為對照樣本。連接電源打開電泳儀器開關。 調節電壓在80~100 V，電泳時間約20 min完成。

1.2.6 實驗室結果檢測 檢測血管癡呆患者和健康人的TOMM40 基因多態性位點的基因型、等位基因型和單倍體型分布的特征特定情況，得出結果。

1.3 統計方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據分析，根據數據結果采用單因素和多因素非條件Logistic 分析相關性, 分析環境因素作為變量對血管性癡呆患者數據的影響值，釆用非條件Logistic 分析TOMM40基因位點與血管性癡呆患者數據的相關性， 分析基因-環境因素的交互作用數據結果用多因子降維法（GMDR），P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血管性癡呆患者環境因素多元線性回歸分析

以環境因素為因變量，進行多元線性回歸分析，以標準化回歸系數判斷自變量對因變量的影響相關性，經過分析發現生活飲食、氣溫氣候是血管性癡呆患者的影響因素（P＜0.05）。 見表 1。

表1 血管性癡呆患者環境因素多元線性回歸分析

2.2 TOMM40 的 Logistic 回歸分析

Logistic 回歸分析顯示，TOMM40 的 rs2075650位點基因型分布與血管性癡呆發病風險相關（P<0.05），見表2。

表2 TOMM40 基因型分布與血管性癡呆發病風險的相關性

2.3 基因-環境因素的交互分析結果

TOMM40 基因交互作用的 GMDR 模型分析結果針對篩選的與生活習慣、 環境因素相關的因素在病例組和對照組的基因分型結果，采用GMDR 分析各 SNP 之間的交互作用關系，發現至少3 種模型與血管性癡呆的發病具有相關性（P＜0.05），見表 3。

表3 TOMM40 基因-環境因素交互分析

3 討論

該研究結果顯示， 以標準化回歸系數判斷自變量對因變量的影響，經過分析發現生活飲食、氣溫氣候是血管性癡呆患者的影響因素（P＜0.05）。相關學者研究發現，中年患者在外用餐機會較多，生活飲食可能與職業壓力和社交有關。 同時由于北方天氣寒冷飲食習慣相比南方天氣影響血管癡呆性疾病的相關性增加[10]。 證實血管癡呆性疾病與患者的生活飲食習慣和當地的氣溫氣候的影響著密切關聯。

TOMM40 基因是線粒體外膜轉運酶40 基因，該基因定位于19ql3.2，是外膜轉移酶(TOM)形成的聚合體，同樣是蛋白進入線粒體入口的重要通道，最終形成的亞基基因因子，TOMM40 基因參與蛋白質導入線粒體的機制和原理過程不可缺少。 已證實線粒體為細胞的活性提供了能量物質， 線粒體的功能可以復制和表達DNA， 同時調控細胞核內的基因。TOMM40 表達異常將導致線粒體功能障礙， 組織中央自由基增多，造成腦組織損傷。目前國內外大量研究結果表明， 晚期阿爾茨海默病的發病因素與TOMM40 基因的 rs2075650 位點 poly-T 重復序列的長度具有密切的相關性[11-13]，與該研究結果一致。以往有研究報道證實，TOMM40 基因rs2075650 位點多態性研究結果與腦梗死的發生呈正相關性（OR=0.391，P＜0.05）。 與該研究結果一致，該文研究結果呈正相關（OR=0.687，P＜0.05）。提示以上位點可能改變基因功能， 并最終影響血管性癡呆的發生與發展。TOMM40 基因的表達異常結果，可以直接影響到線粒體蛋白質的輸入輸出功能， 從而引起細胞核編碼蛋白質向線粒體轉運作用受到阻礙， 無法正常工作，使其不能正常進入線粒體內，導致線粒體無法發揮正常作用，最終引發線粒體的功能出現障礙，無法正常工作，從而線粒體會產生更多的氧自由基，如此反復最終形成了惡性循環， 反復發作進而影響腦組織的正常生理功能[14-16]。 相關學者對TOMM40 多態性與LOAD 的關系研究對我國北方漢族人群中得到證實結論， 方法是分別檢測了是 rs2075650、rs157580 和 rs11556503 個 SNP 位點，中國漢族人群的LOAD 發病機制中TOMM40 基因多態性密切相關起到十分重要的作用[17-18]。TOMM40 基因交互作用的GMDR 模型分析結果針對篩選的與生活習慣、環境因素相關的因素在病例組和對照組的基因分型結果， 采用GMDR 分析了各 SNP 之間的交互作用關系，認為血管性癡呆的發病至少有3 種LOAD 具有密切相關（P＜0.05），血管性癡呆患者的發病因素中Logistic 回歸模型結合GMDR 模型能夠全面分析基因和基因-環境之間的相互作用，起到十分重要的作用。 該研究同樣采用GMDR 分析了各 SNP 之間的交互作用關系，發現至少3 種模型與血管性癡呆的發病具有相關性（P＜0.05）。

綜上所述，為防范、早期診斷及及早治療人類血管性癡呆這類復雜的疾病， 未來需要研究者不斷改善GMDR 模型研究方法，探索新的研究方法，希望通過加大樣本量增加到人群隊列中， 研究得出血管性癡呆疾病的影響因素與基因和基因-環境因素息息相關，從而發現基因、基因和環境等多種因素因子與血管性癡呆疾病之間的相互關聯性， 為下一步研究提供可靠依據。