2周重復給予重組全人源抗新型冠狀病毒單克隆抗體2B11注射液未導致恒河猴出現毒性反應

周建花，桂 芳，張 囡，敬兆飛，樂 鑫，潘勇兵

（武漢生物制品研究所有限責任公司抗體研究室，湖北 武漢 430207）

自2019年12月首次報告新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）感染病例以來[1]，新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）疫情已引起全球大流行。COVID-19的大流行，對全球人類健康、社會生活方式以及經濟發展帶來了巨大影響，迫切需要安全有效的防治手段。具備中和活性的單克隆抗體（單抗）具有靶點明確、特異性好、安全性高、便于大規模制備等優勢，成為COVID-19疫情防控研究的熱點。目前，抗SARS-CoV-2中和抗體藥物的研發進展迅速，國內外已有多款抗體藥物獲批上市或處于Ⅲ期臨床階段。如騰盛博藥醫藥技術有限公司的BRⅡ-196/BRⅡ-198單抗組合和韓國Celltrion生物制藥公司的CT-P59[2]分別在中國和歐盟獲批上市，美國禮來制藥公司的LY-CoV555[3]/LYCoV016[4]、美國再生元制藥公司的 REGN-COV2[5]（REGN10933/REGN10987單抗組合）、美國Vir制藥公司和英國葛蘭素史克公司聯合開發的VIR-7831[6]以及英國阿斯利康制藥公司的 AZD7442[7]（AZD8895/AZD1061單抗組合）等中和單抗均處于Ⅲ期臨床階段，且已取得美國FDA的緊急使用授權。

本實驗室研發的重組全人源抗SARS-CoV-2單克隆抗體（代號2B11）通過噬菌體展示技術篩選獲得，體內外研究結果均顯示，其對SARS-CoV-2具有非常高的中和活性[8]，在用于COVID-19的短期預防及早期治療方面具有較大的臨床應用前景。在完成非臨床藥學研究的基礎上，采用中試規模反應器進行CHO細胞培養制備單抗，并依據相關法規及指導原則[9-13]用恒河猴進行2周重復給藥毒性實驗，觀察其可能引起的毒性反應，包括毒性反應的性質、程度、劑量-反應關系、時間-反應關系和可逆性等，判斷毒性靶器官或靶組織，確定無毒性反應的安全劑量；同時測定不同時間點恒河猴體內的血藥濃度，觀察恒河猴iv給予2B11注射液的給藥劑量、給藥時間與重復給藥毒性之間的關系，為開展相關臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

2B11注射液（20 mg·mL-1，批號202012002），本研究室提供；溶媒對照品0.9%氯化鈉注射液（批號200327521和200612523），武漢福星生物藥業有限公司。

戊巴比妥鈉，德國默克公司；RBD-His蛋白，北京義翹神州科技股份有限公司；淋巴細胞亞群和細胞因子Cytometric Bead Array（CBA）試劑盒，美國BD公司；免疫球蛋白、補體和循環免疫復合物（circulating immunocomplex，CIC）檢測試劑盒，瑞士羅氏公司；TMB顯色液，湖州英創生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG（H+L），美國BETHYL公司；硫酸，國藥集團化學試劑有限責任公司；陽性對照血清（兔抗2B11多克隆抗體血清）和恒河猴陰性血清，湖北天勤生物科技有限公司提供；辣根過氧化物酶標記的2B11單抗，本研究室提供。

手持式裂隙燈（HSL150），德國海尼公司；檢眼鏡（YZ11D），蘇州六六視覺科技股份有限公司；血壓計（BP-2010E），北京軟隆生物技術有限公司；動物心電圖機（ECG-1103GVET），深圳市凱沃爾電子有限公司；全自動模塊式血液體液分析儀（XN-1000IV）和全自動生化分析儀（BX-3010），日本希森美康公司；全自動凝血分析儀（ACLTO-P300-CTS），美國沃芬集團；多參數電解質分析儀（Klite8G），廣東康立公司；干化學尿液分析儀（H800），長春迪瑞醫療科技股份有限公司；流式細胞儀（BD FACS Calibur），美國BD公司；酶標儀（Bio-Rad），美國Bio-Rad公司。

1.2 動物、分組和給藥

普通級恒河猴，體重3.04～4.90 kg，年齡3～5歲，雌雄各半，湖北天勤生物科技有限公司；實驗動物生產許可證號：SCXK（鄂）2016-0010；實驗動物質量合格證號：No.421218300000129和No.4212-18300000133；實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2016-0090；本實驗所涉及的動物管理、使用和相關操作均經過湖北天勤生物科技有限公司實驗動物管理和使用委員會審核與批準，批準文號：IACUC（準）-2020-160。

選取30只健康恒河猴，隨機分成3組，每組10只，雌雄各半。溶媒對照組給予0.9%氯化鈉注射液，實驗組分別給予2B11 100和400 mg·kg-1。首次給藥前2 d定義為-D2，給藥首天定義為D1，依此類推。每隔6天iv給藥1次，分別在D1、D8和D15給藥，2周共給藥3次，給藥體積為20 mL·kg-1。給藥結束后（D23）每組解剖雌雄恒河猴各3只；剩余每組雌雄各2只，恢復9周，恢復期結束后（D78）解剖。

1.3 一般癥狀觀察及體重、體溫和攝食量檢測

給藥后每天進行外觀體征、行為活動、姿勢、飲食、被毛、刺激反應、腺體分泌物、排泄物、呼吸狀態和死亡數等一般癥狀觀察；-D2，D7，D14，D21，D28，D35，D42，D49，D56，D63，D70和D77對各組恒河猴稱量體重；-D2，D1，D8，D15和D77對各組恒河猴進行體溫測量（肛溫）；記錄實驗期間攝食量。

1.4 眼科檢查、血壓和心電指標檢測

-D2，D21和D77用手持式裂隙燈和檢眼鏡分別對各組所有動物進行眼瞼、結膜、角膜、瞳孔和虹膜等眼科檢查；-D2，D8，D15和D77分別對各組恒河猴收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）和平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）等血壓指標檢測及心率（heart rate，HR）、QRS時限、Q-T間期和P-R間期等心電指標進行檢測。

1.5 血常規、止凝血、血液生化、電解質及尿液一般指標檢測

-D1，D22和D78采集全血進行血常規、止凝血、血液生化、電解質及尿液一般指標檢測。使用血液體液分析儀檢測全血中白細胞（white blood cell，WBC）數、紅細胞（red blood cell，RBC）數、血紅蛋白（hemoglobin，HGB）、紅細胞 壓積（hematocrit，HCT）、平均紅細胞血紅蛋白量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）和平均紅細胞體積（mean corpuscular volume，MCV）等血常規指標。使用凝血分析儀檢測血清中部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、血漿凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、血漿凝血酶時間（thrombin time，TT）和纖維蛋白原（fibrinogen，FIB）等止凝血指標。使用多參數電解質分析儀和生化分析儀檢測血清中葡萄糖（glucose，GLU）、甘油三酯（triglycerides，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TCHO）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和Cl-等血液生化及電解質指標。

分別于-D1，D21和D77對尿液顏色進行觀察，并使用干化學尿液分析儀進行透明度、尿糖和尿蛋白等尿液指標檢測。

1.6 臟器系數和組織病理檢測

用戊巴比妥鈉麻醉恒河猴后解剖，肉眼觀察臟器是否有異常。然后進行臟器系數檢測，稱重并計算臟器系數的臟器有腦、心、肝、腎、子宮、卵巢和睪丸等。最后用HE染色進行組織病理檢測。

1.7 免疫學指標檢測

1.7.1 淋巴細胞亞群、免疫球蛋白、補體及ClC水平檢測

分別于-D1，D22和D78進行淋巴細胞亞群、免疫球蛋白、補體及CIC檢測。按照淋巴細胞亞群檢測試劑盒的說明書進行操作，對全血中CD3+，CD4+，CD8+，CD20+和 CD16+等分子進行染色，然后使用流式細胞儀檢測T、B、NK淋巴細胞亞群（CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD3-CD20+和CD3-CD16+）的百分比及 CD3+CD4+/CD3+CD8+比值。分別按照免疫球蛋白、補體和CIC檢測試劑盒的說明書進行操作，使用生化分析儀檢測血清中免疫球蛋白（IgA，IgG和IgM）和補體（C3和C4）含量，使用酶標儀檢測血清中CIC含量。

1.7.2 細胞因子水平檢測

分別于-D1，D1給藥后2和24 h，D22和D78進行血清細胞因子檢測。按照CBA試劑盒的說明書進行操作，將血清與有特定熒光強度的CBA微球進行共孵育，然后加入熒光標記的檢測試劑形成復合物，使用流式細胞儀檢測白細胞介素2（interleukin 2，IL-2）、IL-4、IL-5、IL-6、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）和干擾素 γ（interferon γ）等細胞因子水平。

1.8 抗藥抗體（anti-drug antibody，ADA）濃度檢測

分別于-D1，D8，D15，D22，D29，D36，D50，D57和D78，采用橋聯-ELISA法檢測血清中ADA濃度。2B11注射液稀釋至5 mg·L-1包被于酶標板中，用醋酸0.6 mol·L-1酸化處理待檢血清、陽性對照血清（兔抗2B11多克隆抗體血清）和恒河猴陰性血清，待血清中ADA和藥物復合物解離后加入酶標板，與2B11抗體結合，洗板去除未結合的抗體和其他成分。再進行酸化處理，使ADA與2B11的結合解離，將ADA重新包被于另一塊酶標板上，與辣根過氧化物酶標記的2B11單抗結合，洗滌后加入TMB顯色液進行顯色反應，終止反應后用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度（A450nm）值。

為避免外界環境因素對實驗結果的影響，本實驗所有孔均設復孔，并采用信噪比（signal noise ratio，SNR）替代A450nm值計算所有參數，SNR=待檢血清或陽性對照血清A450nm均值/陰性血清A450nm均值。經方法學驗證，篩選閾值（screening cut point，SCP）的SNR為1.195，陽性對照血清SNR＞1.589，陰性血清A450nm＜0.085。若待檢血清的SNR≥SCP，則表示該樣本為陽性，反之則為陰性。

1.9 毒代動力學（toxicokinetics，TK）參數檢測

溶媒對照組分別在D1和D15給藥前0 h及給藥后2 h，2B11 100和400 mg·kg-1組D1給藥前（0 h）及給藥結束后0.167，2，8，24，72，120和168 h，D8給藥前（0 h）及給藥后2 h，D15給藥前（0 h）及給藥結束后0.167，2，8，24，72，120和168 h采血并分離血清，采用配體結合ELISA法檢測其血藥濃度。RBD-His抗原稀釋至1 mg·L-1包被于酶標板中，與2B11單抗或待測血清中的2B11結合，然后與辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG抗體結合，顯色并終止后測定A450nm值。制備標準曲線，代入標準曲線方程計算血清中2B11濃度，用GraphPad Prism8.0.1軟件擬合藥物濃度-時間曲線，用Phoenix WinNonlin軟件非房室模型計算毒代動力學參數，對最大血藥濃度（Cmax）、達峰時間（Tmax）和藥物濃度-時間曲線下面積（AUC0-t）等毒代動力學參數進行評估。

1.10 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，當樣本量≤2時，僅列出個體數據，不進行統計；計量資料，如體重、血常規、止凝血、血液生化和電解質等，進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗；計數資料采用卡方檢驗；等級資料采用Kruskal-WallisH檢驗，總體差異有統計學意義時用Mann-WhitneyU檢驗進行組間差異的比較；P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 恒河猴一般癥狀、體重、攝食量和體溫變化

實驗期間，2B11 2個劑量組恒河猴無死亡，恒河猴外觀體征、行為活動、姿勢、飲食、被毛、刺激反應、腺體分泌物、排泄物和呼吸狀態等均未見明顯異常，體重無明顯變化，亦未出現攝食量減少情況。與溶媒對照組比較，D15 2B11 100和400 mg·kg-1組雄性恒河猴體溫均升高（P＜0.01），D77各組雌雄恒河猴體溫未見明顯趨勢性改變（表1）。上述指標的改變輕微或在正常值范圍內，不具有毒理學意義。

Tab.1 Effect of 2-week repeated administration toxicity test of 2B11 injection on body temperature，blood pressure，electrocardiogram，blood routine,anticoagulation，blood biochemistry and electrolytes of rhesus monkeys

Tab.1(continued)

2.2 眼科檢查、血壓和心電圖變化

實驗期間，與溶媒對照組比較，2B11 2個劑量組恒河猴眼科檢查及血壓指標DBP和MAP未見明顯變化。與同組給藥前比較，D8溶媒對照組和400 mg·kg-1組雄性恒河猴SBP顯著降低（P＜0.05）；D8和D15，100 mg·kg-1組雌性恒河猴SBP降低（P＜0.05）（表1）。SBP波動范圍較小（7.8%～20.3%），無明顯劑量-反應關系或時間-反應關系，與同期溶媒對照組比較均無統計學差異，故可認為上述血壓指標的變化不具有毒理學意義。

實驗期間，與溶媒對照組比較，2B11 2個劑量組恒河猴Q-T間期和P-R間期心電指標未見明顯變化。與同期溶媒對照組相比，D15 100 mg·kg-1組雄性恒河猴HR顯著升高（P＜0.05）。與同組給藥前相比，400 mg·kg-1組雌雄恒河猴HR降低（P＜0.01）；D8和D15，溶媒對照組雄性恒河猴QRS時限均顯著升高（P＜0.05）（表1）。與給藥前比較，溶媒對照組心電指標雖變化幅度較大，但因未給予受試物，考慮為動物正常的生理性波動；D15，100和400 mg·kg-1組恒河猴的HR變化幅度較小，且無明顯劑量-反應關系，與同期溶媒對照組比較均無統計學差異。

2.3 血常規、止凝血、血液生化、電解質及尿液一般指標變化

實驗期間，與溶媒對照組比較，2B11 2個劑量組恒河猴WBC，HGB和HCT等血液學指標未見明顯變化。D22，與同期溶媒對照組比較，100 mg·kg-1和400 mg·kg-1組雌性恒河猴RBC均降低（P＜0.05），MCH均升高（P＜0.05），100 mg·kg-1組雌性恒河猴MCV升高（P＜0.05）。與同組給藥前比較，100和400 mg·kg-1組雄性恒河猴MCV均升高（P＜0.01），100 mg·kg-1組雄性恒河猴和400 mg·kg-1組雌性恒河猴MCH升高（P＜0.05）（表1）。以上血常規指標的變化雖然具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），但與同期溶媒對照組比較，給藥前（-D1）100 mg·kg-1組雌性恒河猴RBC，MCV和MCH已存在統計學差異（P＜0.01），且這些指標均在小范圍內波動，無明顯劑量-反應關系。

實驗期間，與同期溶媒對照組比較，2B11 2個劑量組雌雄恒河猴APTT，PT，TT和FIB等止凝血指標均無明顯變化。D22，與同組給藥前比較，溶媒對照組雄性恒河猴APTT和TT均升高（P＜0.05），100 mg·kg-1組雄性恒河猴PT和TT均升高（P＜0.05），FIB降低（P＜0.05）；100 mg·kg-1組雌性恒河猴TT升高（P＜0.05），100和400 mg·kg-1組雌性恒河猴FIB均降低（P＜0.05）（表1）。與給藥前比較，溶媒對照組雄性恒河猴APTT和TT均升高，雖變化幅度較大，但溶媒對照組恒河猴僅給予氯化鈉注射液；100和400 mg·kg-1組其他止凝血指標雖變化幅度較大，但與同期溶媒對照組比較均無統計學差異，且無明顯劑量-反應關系。

實驗期間，與溶媒對照組比較，2B11 2個劑量組恒河猴GLU，TG和TCHO等血液生化及電解質指標均無明顯變化。D22，與同期溶媒對照組比較，400 mg·kg-1組雄性恒河猴ALP降低（P＜0.05），雌性恒河猴Cl-濃度升高（P＜0.01）。與同組給藥前比較，溶媒對照組和100 mg·kg-1組雄雌恒河猴Cl-濃度降低（P＜0.05）（表1）。400 mg·kg-1組雄性恒河猴ALP變化幅度較大（34.1%），但單純的ALP降低，其他指標無異常，可認為單純的ALP降低無明確毒理學意義；400 mg·kg-1組雌性恒河猴和100 mg·kg-1組雄雌性恒河猴Cl-變化幅度較小。

實驗期間，與溶媒對照組比較，2B11 2個劑量組送檢尿液樣本外觀均為正常的黃色或淡黃色的澄明液體，各尿液指標未見明顯異常的規律性變化。

2.4 臟器系數和組織病理變化

D22和D78，與溶媒對照組比較，2B11 2個劑量組恒河猴臟器重量和系數均無明顯變化。

D22，與溶媒對照組比較，2B11 2個劑量組恒河猴未見與給藥相關的病理改變（部分病理圖結果見圖1），僅有部分恒河猴可觀察到常見的自發性背景性病變（病變總結見表2）。如肉眼可見雄性恒河猴生殖系統（睪丸、附睪、前列腺及精囊腺）體積小，組織病理學觀察見其未發育成熟，但是這些指標與動物年齡和生長發育相關；少數恒河猴肉眼可見腦表面顏色呈淡黃色，腦組織與硬腦膜粘連，組織病理學觀察見大腦腦膜纖維結締組織輕度增生，這些自發性背景性病變均與受試物不相關。溶媒對照組和2B11 2個劑量組部分恒河猴出現了一些輕微或輕度病理改變，溶媒對照組（3/6）和100 mg·kg-1組（1/6）腎組織輕微或輕度局灶炎癥細胞浸潤；溶媒對照組（2/6）和400 mg·kg-1組（2/6）給藥局部血管周圍結締組織成纖維細胞輕微或輕度增生。溶媒對照組未出現但100 mg·kg-1組恒河猴出現的一些輕微病理改變，如100 mg·kg-1組（1/6）肺輕微瘀血；（1/6）肺血管內見均質紅染物，內含中性粒細胞；（1/6）腮腺局灶性炎癥細胞輕微浸潤，以淋巴細胞為主；（1/6）胃黏膜炎癥細胞輕微浸潤，以淋巴細胞為主。綜上所述，上述病變鏡下表現的程度均為輕微或輕度，各組間出現病變恒河猴的數量和病變程度未見明顯差異，無明顯劑量-反應關系。D78，與溶媒對照組相比，100和400 mg·kg-1組恒河猴各臟器均未見明顯與給藥相關的病理改變。

Tab.2 Summary of spontaneous lesions in rhesus monkeys after 2-week repeated administration of 2B11 injection

Fig.1 HE staining results of partial histopathological examination in rhesus monkeys after 2-week repeated administration toxicity test of 2B11 injection at D22.See Tab.1 for the animal treatment.Black arrows indicate where the tissue was diseased.Some animals in 400 mg·kg-1group had mild hyperplasia of cerebral meningeal fibrous connective tissue，while some in the solvent control group had slight or mild infiltration of focal inflammatory cells and mononuclear cells in the kidney.Reproductive systems（testis and epididymis）of some male animals were small in each group.

2.5 免疫學指標變化

2.5.1 淋巴細胞亞群（T、B和NK淋巴細胞亞群）水平

實驗期間，與溶媒對照組比較，2B11 2個劑量組恒河猴 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+和 CD3-CD16+等淋巴細胞亞群百分比及CD3+CD4+/CD3+CD8+比值均無明顯變化。D22，與同組給藥前比較，溶媒對照組雌雄性恒河猴CD3-CD20+淋巴細胞亞群百分比降低（P＜0.05），100 mg·kg-1組雌性恒河猴CD3-CD20+淋巴細胞亞群百分比降低（P＜0.05）（表3）。因溶媒對照組僅給予氯化鈉注射液，引起的范圍波動認為是動物正常的生理性波動；100 mg·kg-1組雌性恒河猴CD3-CD20+淋巴細胞亞群百分比的變化無明顯劑量-反應關系，且與同期溶媒對照組比較均無統計學差異。

Tab.3 Effects of 2-week repeated administration toxicity test of 2B11 injection on immunological of rhesus monkeys

2.5.2 免疫球蛋白水平

實驗期間，與溶媒對照組比較，2B11 2個劑量組恒河猴IgA和IgM檢測結果無明顯變化。D22，與同期溶媒對照組比較，100和400 mg·kg-1組雄性恒河猴IgG含量升高（P＜0.05）；與同組給藥前比較，溶媒對照組雄性恒河猴IgG含量升高（P＜0.05），100和400 mg·kg-1組雌雄恒河猴IgG含量均升高（P＜0.05）（表3）。溶媒對照組僅給予氯化鈉注射液，前后差異認為是動物正常生理性波動；100和400 mg·kg-1組恒河猴IgG含量升高是由于2B11本身是一種免疫球蛋白（IgG），重復iv給予2B11注射液，會提高恒河猴體內IgG含量，隨著給藥期結束IgG含量也會降低。

2.5.3 補體和ClC水平

D22，與同組給藥前比較，400 mg·kg-1組雄性恒河猴C3含量升高（P＜0.05），100 mg·kg-1組雌性恒河猴C4含量降低（P＜0.05）（表3）。上述補體含量的波動范圍較小，且與同期溶媒對照組比較均無統計學差異，亦無明顯劑量-反應關系，認為改變不具有毒理學意義。實驗期間，與溶媒對照組比較，2B11 2個劑量組恒河猴CIC含量無明顯變化。

2.5.4 細胞因子水平

實驗期間，與溶媒對照組比較，2B11 2個劑量組恒河猴IL-2，IL-4，IL-5，TNF-α和IFN-γ等細胞因子含量無明顯變化。D1給藥后2 h，與同組給藥前比較，10和400 mg·kg-1組雌雄恒河猴IL-6含量均升高（P＜0.05）；D1給藥后24 h，IL-6含量均恢復正常（表3）。上述IL-6含量的變化可能與當天給予較大體積的受試物引起動物不舒適有關，且與同期溶媒對照組比較均無統計學差異。一過性IL-6含量升高考慮為動物免疫應激反應，認為上述變化不具有毒理學意義。

2.6 ADA濃度變化

ADA檢測過程中，不同分析批陽性對照血清SNR＞1.589，陰性血清A450nm＜0.085。實驗期間，2B11 2個劑量組恒河猴血清中ADA檢測結果全部為陰性。

2.7 毒代動力學參數

D1，D8和D15給藥后，100和400 mg·kg-1組恒河猴體內血藥濃度-時間曲線見圖2。D1，D8和D15給藥后2 h，血漿藥物濃度均比前一次給藥后濃度高；D1和D15給藥后，100和400 mg·kg-1組血漿藥物濃度變化基本一致，且與給藥劑量呈正比。

Fig.2 Plasma drug concentration-time curve of 2B11 injection in rhesus monkeys after 2-week repeated administration toxicity test.See Tab.1 for the animal treatment.A，B and C are plasma drug concentration-time curves after the D1，D8 and D15 administration，respectively.±s,n=10.

D1和D15給藥后，100和400 mg·kg-1組恒河猴血藥濃度達峰時間Tmax、峰濃度Cmax和AUC0-t值見表4。D1給藥后，100和400 mg·kg-1組劑量比為1∶4，Cmax之比為1∶4.58，AUC0-t之比為1∶4.77；D15給藥后，100 和400 mg·kg-1組劑量比為 1∶4，Cmax之比為1∶4.06，AUC0-t之比為 1∶3.81；D1和D15給藥后，100 和400 mg·kg-1組Cmax之比、AUC0-t之比與給藥劑量呈正比，2B11注射液在體內基本呈線性動力學特征。D15與D1給藥后，100和400 mg·kg-1組Cmax的比值分別為2.07±0.41和1.82±0.25，AUC0-t的比值（蓄積因子）分別為2.59±0.50和2.03±0.14，認為2周內連續給藥3次2B11后，2B11在恒河猴體內未表現出明顯蓄積。

Tab.4 Mean toxicokinetic parameters of 2B11 injection in rhesus monkeys after 2-week repeated administration toxicity test

3 討論

非臨床安全性評價的主要目的包括確定人體安全起始劑量和后續劑量遞增方案；確定潛在毒性靶器官，并研究該毒性是否可逆；確定臨床監測的安全性指標，可用于解釋人體研究啟動前至整個臨床開發過程中的藥理學和毒理學作用[11]。重復給藥毒性實驗是臨床前安全性評價的重要內容，可以確定未觀察到臨床不良反應的劑量水平（no observed adverse effect level，NOAEL），并推測第一次臨床試驗的起始劑量，為后續臨床試驗提供安全劑量范圍[12]。

本實驗給藥期結束和恢復期結束，2B11 2個劑量組恒河猴一般癥狀觀察、體重、攝食量、體溫、眼科、血壓、心電圖、血常規、止凝血、血液生化及電解質、尿液、臟器系數、組織病理學和免疫學檢測等指標均未見與受試物有關的明顯改變。

劑量選擇應能提供反映劑量-反應關系的信息，包括毒性劑量和NOAEL。本實驗室前期對COVID-19易感的Ad5-hACE2小鼠模型體內進行藥效學實驗，評價了2B11對小鼠感染SARS-CoV-2的預防和治療效果[8]。結果顯示，與PBS對照組相比，給予2B11 75 mg·kg-1實驗組，第6天預防組小鼠體重基本無下降，肺部病毒載量降低100倍以上；治療組小鼠體重下降幅度較小，肺部病毒載量降低10倍以上。以上結果表明，2B11 75 mg·kg-1在Ad5-hACE2非轉基因小鼠模型中能較大程度預防和治療SARS-CoV-2感染。根據已進入臨床階段的抗SARS-CoV-2抗體藥物實驗方案[14-15]，初步確定2B11臨床最大擬用劑量為50 mg·kg-1，再結合恒河猴單次靜脈給藥初步的藥動學和毒性預實驗，以及2周重復靜脈給藥毒性預試驗結果，最終確定本研究2B11注射液劑量分別為100（臨床最大擬用劑量的2倍）和400 mg·kg-1（臨床最大擬用劑量的8倍）。

ADA檢測的主要干擾物質為藥物本身，當ADA和藥物以復合物的形式存在時，使測定信號值比實際偏低，通過酸解離可將ADA從復合物中解離，以降低復合物對結果的干擾[16-17]。本實驗醋酸對樣本的酸化處理可使樣品的pH值處于可使ADA和藥物復合物解離的狀態，但又不影響ADA的檢測[18]，然后采用橋聯ELISA對恒河猴體內ADA濃度進行檢測。本實驗2B11 2個劑量組恒河猴ADA均為陰性，考慮是動物給藥劑量過大導致藥物和ADA形成復合物使測定信號值偏低[19]。重復給藥2周后，2B11注射液100和400 mg·kg-1組血漿藥物濃度變化基本一致，峰濃度之比、暴露量之比與給藥劑量呈正比，2B11注射液在恒河猴體內基本呈線性動力學特征。

綜上認為，在本實驗設定條件下，恒河猴2周重復iv給予2B11注射液是安全的。再結合2B11注射液對恒河猴的其他非臨床安全性評價結果，如安全藥理實驗中，單次iv給予2B11 100和400 mg·kg-1，對恒河猴心血管及呼吸系統無明顯影響；組織交叉反應實驗中，生物素標記的2B11單抗1和10 mg·L-1與人和恒河猴的34種冰凍組織均未觀察到特異性著色，與人和恒河猴均無組織交叉反應；免疫毒性試驗中，恒河猴免疫指標的變化與注射2B11注射液100和400 mg·kg-1無關；局部刺激性試驗中，2B11注射液100和400 mg·kg-1連續給藥3周，恒河猴給藥局部血管、肌肉及皮膚未見與受試物相關的刺激性反應等（結果未發表），表明2B11注射液的安全性，2B11注射液非臨床安全性評價的NOAEL為400 mg·kg-1，相當于臨床最大擬用劑量的8倍以上。目前，2B11注射液已通過國家藥品監督管理局藥品審評中心的技術審評，正在開展臨床試驗，以評估2B11注射液在人體中使用的安全性和有效性。