超高壓加工對牛奶微生物、熱敏感指標及物理特性的影響

錢文濤，李洪亮，楊晉輝*，王孟輝，陳靜，黨云剛

1. 蒙牛高科乳制品（北京）有限責任公司（北京 101100）；2. 內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司（呼和浩特 011500）；3. 蒙牛乳業（北京）有限責任公司（北京 101100）

隨著我國居民生活水平的逐步提高，人們對于營養攝入也逐漸重視起來。由于我國牛奶主產區域和消費區域的不平衡，加之冷鏈運輸系統不完善，我國市場上牛奶產品以超高溫瞬時滅菌乳（UHT）為主[1]。與巴氏殺菌工藝相比，UHT由于較高的熱加工強度，其牛奶產品中乳鐵蛋白、免疫球蛋白等對人體有益的活性蛋白含量較低[1]。為了降低乳制品加工過程的熱損傷，非熱殺菌的加工工藝成為了牛奶加工新的研究方向。超高壓滅菌通過較高的靜水壓力，破壞微生物的菌體結構，達到殺菌目的，并最大限度地保留了食材原有的感官品質和營養價值[2]。此次試驗目的在于篩選適用于生乳滅菌的超高壓加工工藝條件，通過比較不同壓力條件和維持時間的工藝組合，研究超高壓對生乳中微生物、熱敏感指標和物理特性的影響，為超高壓牛奶產品的生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗分為兩個部分。試驗一用于篩選最優的加工條件，以微生物數量和熱敏感指標分別作為安全指標和牛奶熱損傷指標，對影響超高壓加工效果的加工壓力和維持時間的兩個因素進行篩選，選擇微生物數量最低和牛奶熱損傷最小的加工壓力時間組合，作為優化加工條件。試驗二用于研究超高壓加工對牛奶物理特性的影響，對不同加工壓力和時間組合下加工牛奶以及生鮮乳的粒徑、色差等指標進行對比分析。

1.2 樣品加工

生乳樣品由蒙牛乳業（太原）有限公司提供，采集奶罐車上的大罐樣品，樣品采集完成后，2 h內冷藏運送至三水河公司進行加工，加工設備為立式加壓SSH試驗機，容積8.8 L，壓力艙溫度設置為25 ℃。試驗一中設備壓力分別設置為200，400和600 MPa，維持時間分別是5，30和60 min，每個加工壓力和時間的組合重復3次，即進行3個批次生乳的加工，共計30個樣品（包括原奶）。樣品一部分送至山西大學生命科學學院進行微生物學檢測，另一部分冷凍保存，送至蒙牛中心實驗室檢測熱敏感指標。試驗二中采用試驗一優化所得加工條件（600 MPa維持15 min），同時設置200 MPa維持15 min、400 MPa維持15 min、600 MPa維持5 min、600 MPa維持30 min等試驗處理組，進行3批次加工試驗，以生乳為對照組，共計18個樣品。所有樣品冷藏條件下運回蒙牛中心實驗室，進行物理特性的檢測。兩次試驗中生乳成分信息由蒙牛乳業（太原）有限公司提供，如表1所示。

表1 生鮮乳成分指標（平均值±標準差）

1.3 微生物和熱敏感指標的檢測

牛奶樣品中微生物檢測指標包括菌落總數、大腸菌群計數、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，分別采用GB 4789.2—2016[3]、GB 4789.3—2016[4]、GB 4789.10—2016[5]和GB 4789.4—2016[6]方法進行平板檢測，每個樣品做2個重復。熱敏感檢測指標包括乳果糖、糠氨酸、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳過氧化物酶。乳果糖和糠氨酸的檢測方法參照NY/T939—2016[7]。其中：糠氨酸的檢測采用配有紫外檢測器的高效液相色譜儀；α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的檢測參照T/TDSTIA 007—2019[8]，檢測設備為配備有紫外檢測器的高效液相色譜儀；乳過氧化物酶的檢測采用evergreen試劑盒（美國，EC401117）檢測方法進行檢測。

1.4 物理特性分析

加工牛奶物理指標的檢測包括粒徑和色差。利用Beckman Coulter LS13320激光粒度分析儀分析產品粒徑分布，結果以顆粒粒徑在不同尺度上的百分占比表示。色差分析通過X-riteRM200色差儀進行分析，將樣品盛放于透明的樣品瓶中，用校正過的色差儀光源貼到外瓶壁進行檢測，整個操作在避光條件下進行，結果包括L、a、b3個參數，以生乳色澤為基準，其中：L為深淺指數，ΔL＞0，顏色偏淺，ΔL＜0，顏色偏深；a為紅綠指數，Δa＞0，顏色偏紅，Δa＜0，顏色偏綠；b為黃藍指數，Δb＞0，顏色偏黃，Δb＜0，顏色偏藍。

1.5 數據分析

試驗一中，微生物數量經過log10轉換后進行統計分析，微生物數量和熱敏感指標含量以加工壓力和時間作為模型主效應進行方差分析。試驗二中，色差數據統計時以試驗分組進行Anova分析。統計分析利用R軟件（V 3.6.1）完成。粒徑數據利用Unscrambler 10.4軟件進行主成分分析，導出圖示進行結果說明。

2 結果與討論

2.1 微生物

試驗中不同批次生鮮乳和加工乳中的微生物指標如表2所示。所有產品中的沙門氏菌均未檢出。加工壓力極顯著影響了微生物的數量（p＜0.01）。當加工壓力超過400 MPa時，加工中的微生物指標顯著低于生乳；當加工壓力為600 MPa時，樣品中大腸桿菌未檢出，三批次加工樣品中僅有一批次菌落總數為3～110 CFU/mL，金黃色葡萄球菌為2～6 CFU/mL，其余兩批次未檢出。而加工時間對微生物影響不顯著（p＞0.05），加工時間為5，30和60 min時，加工樣品間的微生物指標并無顯著差別，但均低于生乳。

表2 超高壓加工壓力和時間對牛奶中微生物指標的影響

有研究表明，超高壓加工的壓力在300～500 MPa，隨著殺菌壓力的升高，殺菌效果逐漸增強[9-11]，而加工壓力為100～200 MPa時，殺菌效果并不明顯[9]，研究得到相似的研究結果。前人研究中，加工時間對于殺菌效果的影響要小于加工壓力，隨著加工時間的延長，殺菌效果會有所改善[9-11]，但此次研究中加工時間的效應并未得到證明。就此次研究的試驗結果而言，600 MPa加工條件下微生物的存活數量最低，加工時間對微生物指標影響較小，而其他研究表明400 MPa條件下，超過30 min的加工并不會降低牛奶中微生物的數量[10]，因此，考慮到加工時間對殺菌效果可能的改善作用以及生產過程的時間成本，牛奶適宜的超高壓殺菌條件是600 MPa維持10～30 min。

2.2 熱敏感指標

生乳和加工樣品中熱敏感指標如表3所示。加工壓力對牛奶中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的濃度影響極顯著（p＜0.01）。壓力為200 MPa時，加工樣品兩種蛋白含量與生乳相似（p＞0.05）；當壓力升至400 MPa時，加工樣品中β-乳球蛋白含量顯著低于生乳（p＜0.05）；當加工壓力為600 MPa時，樣品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白均顯著低于生乳和200 MPa加工樣品中的含量（p＜0.05）。加工時間會顯著影響樣品中β-乳球蛋白含量，隨著加工時間的延長，β-乳球蛋白濃度顯著下降（p＜0.05）；加工60 min后樣品β-乳球蛋白的平均含量為加工5 min樣品含量的53.5%。α-乳白蛋白含量隨加工時間延長僅有下降的趨勢（0.05＜p＜0.1）。其他熱敏感指標隨加工壓力和時間的變化均無顯著變化（p＞0.05）。

表3 超高壓加工壓力和時間對牛奶熱敏感指標的影響

已有研究證明，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白在加工壓力分別超過400和100 MPa就發生了變性，并且隨著加工時間延長，變性程度會進一步上升[12-13]。在此次研究中，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分別在大于400 MPa和大于200 MPa的壓力條件下含量明顯降低，并且加工時間延長也會造成兩種蛋白含量的降低，這與前人研究結果相一致。β-乳球蛋白對于加工壓力和時間的變化比α-乳白蛋白更為敏感，這可能是由于β-乳球蛋白含有自由巰基和更多的二硫鍵[12-13]，在壓力條件下更容易發生變性，并且α-乳白蛋白是一種金屬蛋白，與牛奶中鈣離子的結合有助于維持其結構穩定性[14]。糠氨酸和乳果糖是牛奶在熱加工過程中發生美拉德反應和乳糖異構化的標志性產物[14]，其比乳清蛋白變性更能有效標識牛奶的熱加工強度。超高壓加工在未加熱的狀態下并不會引起牛奶的熱變化，其產品非酶褐變程度與乳果糖含量和生乳相似[15]，研究中加工樣品糠氨酸和乳果糖含量的無顯著變化也證明了這一點。乳過氧化物酶活性經常被用于估計巴氏殺菌熱加工強度的上限，防止過熱加工[16]。牛奶中的多數內源酶都是耐壓的，包括乳過氧化物酶[13]。在此次研究中，乳過氧化物酶的活性未受到加工壓力和時間的影響。從熱敏感指標角度而言，研究600 MPa加工牛奶中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、糠氨酸以及乳果糖的含量與巴殺乳更為接近，優于UHT牛奶[16]。鑒于加工時間的延長會降低α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量，結合超高壓的殺菌效果，此次研究優選的加工工藝條件設定為600 MPa維持15 min。

2.3 物理指標

2.3.1 粒徑

如圖1（A）所示，超高壓加工牛奶的粒徑分布圖和生乳相似，在約0.12 μm和3.0 μm處呈現雙峰。與其他樣品相比，生乳在0.05～0.25 μm處的顆粒比例較高，在1.2～8.2 μm處的顆粒比例較低，而大于400 MPa加工壓力處理的牛奶的顆粒比例呈現相反的趨勢。粒徑分布的主成分分析結果如圖1（B）和1（C）所示。前兩個主成分解釋了粒徑變化94%的變異，其中PC1解釋了粒徑0.04～0.4 μm減小和粒徑1.2～5.2 μm處增大的變化（圖1C）。得分圖（圖1B）顯示生乳在PC1的得分為負，而高于400 MPa加工樣品的PC1得分為正，而200 MPa維持15 min樣品得分居于兩者之間，這表明超高壓加工壓力的增強使得樣品中小顆粒比例減少，大顆粒比例增加。

圖1 樣品粒徑分布圖

有研究觀察到，對于未均質的牛奶粒徑分布呈現雙峰分布[17]，這與此次研究中粒徑分布曲線相似。牛奶中乳脂肪球和酪蛋白膠束的粒徑范圍分別是1～10 μm和0.01～0.1 μm[18]，因此，試驗中0.12和3.0 μm處的雙峰可能分別對應酪蛋白膠束和乳脂肪球的粒徑分布。600 MPa維持3 min的超高壓加工使得生乳的顆粒粒徑增大[2]，其粒徑分布曲線的變化與此次研究中所得到的結果相一致。當超高壓的加工壓力超過250 MPa時，脂肪球傾向于集聚形成脂肪球簇，增大顆粒粒徑[19-20]。高壓加工會促使酪蛋白膠束的解體，酪蛋白顆粒比例減少[21]，而解體的酪蛋白膠束可能會吸附在脂肪球表面，增大脂肪球的粒徑顆粒的比例。

2.3.2 色差

與生乳比較，不同加工工藝條件牛奶的參數差值變化如表4所示。隨著加工壓力的升高，ΔL會逐漸降低。400 MPa維持15 min、600 MPa維持15 min和600 MPa維持30 min的加工樣品顯著低于生乳。同時高壓加工也會促使b升高，600 MPa加工樣品的b值顯著高于生乳。這表明超高壓加工使得牛奶色澤變暗變黃。L值的降低表明參與散射的酪蛋白膠束粒子數減少，伴隨著酪蛋白顆粒的解離，200～400 MPa的加工壓力促使生乳的L值迅速下降和濁度降低[13]。前人研究中，超高壓牛奶與生乳相比，黃色色澤度上升，表現為b值的升高和a值的降低[2,22]，此次研究結果與上述報道相一致，但參數a值無顯著變化。

表4 不同處理牛奶與生乳比較的參數差值

3 結論

在此次研究中，超高壓加工能夠有效降低生乳中的微生物數量，加工壓力起主要作用，而加工時間影響并不明顯。α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量會隨著加工壓力的增大而降低，加工時間的延長也會對這兩種蛋白的變性造成影響，超高壓加工對乳中過氧化物酶以及糠氨酸和乳果糖含量并無影響。通過微生物和熱敏感指標的篩選，將600 MPa維持15 min定為此次研究優化的超高壓加工條件。通過對加工樣品粒徑和色澤的對比研究發現，超高壓加工會使牛奶中0.05～0.25 μm顆粒比例減少，1.2～8.2 μm顆粒比例增加，并且牛奶色澤變暗變黃。