植物病原真菌對甾醇脫甲基抑制劑類殺菌劑抗性分子機制研究進展

劉鳳華, 馬迪成, 張曉敏, 李 金, 劉 峰*,, 慕 衛*,

(1. 山東農業大學 植物保護學院，山東 泰安 271018；2. 中國農業大學 植物保護學院，北京 100193)

0 引言

麥角甾醇 (ergosterol) 是真菌細胞膜的重要組成部分，對于調節細胞膜的流動性、滲透性及完整性有重要意義[1-2]。麥角甾醇在細胞膜中的含量最多，它在膜微區優先與鞘磷脂結合[3-4]，參與質膜融合和胞間運輸，調控脅迫響應、孢子形成等多個生物學過程[5]；麥角甾醇也存在于線粒體、液泡、過氧化物酶體和內質網等細胞器的內膜系統中，對于胞內信號轉導、物質轉運、同型液泡融合和遺傳等過程具有重要意義[6]。此外，麥角甾醇還能作為真菌的病原相關分子模式 (PAMP)，在真菌侵染植物細胞時，誘導相關基因的表達，觸發植物早期防御反應[7]。有研究顯示，麥角甾醇可誘發WRKY 轉錄因子、脂質轉運蛋白 (LTP1) 和二苯乙烯合成酶 (VST1) 基因在植物體內表達，保護植株免受灰霉病菌侵染，增強植株抗病能力[8]。

由于麥角甾醇在真菌細胞中的重要性以及特異性，其生物合成途徑中的關鍵酶14α-去甲基化酶 (CYP51) 成為抗真菌藥物的理想靶標。甾醇脫甲基抑制劑 (DMI) 屬于含氮雜環類化合物，依據其化學結構可分為三唑類、咪唑類、嘧啶類、吡啶類和哌嗪類[9]，目前該類殺菌劑已廣泛應用于多種作物病害的防治，對小麥赤霉病、水稻紋枯病、小麥葉銹病和桃褐腐病等均具有良好的防治效果。其中應用最廣泛的是三唑類化合物，其不僅具有良好的抑菌活性，還能控制作物莖稈伸長、增強植株抗逆能力、提高產量等，對植物生長具有一定的調節作用[10-12]。然而，隨著DMI 類殺菌劑的廣泛應用，植物病原菌對其抗性問題日益嚴峻，在中國、澳大利亞等多個地區均檢測到對其產生抗性的病原菌[13-16]。因此了解并研究DMI 類殺菌劑的作用機制和抗性分子機制，不僅可以實現田間科學用藥，延緩抗藥性發生，而且對于開發并豐富DMI 類殺菌劑具有現實意義。

1 DMI 類殺菌劑作用機制

在真菌麥角甾醇的合成途徑中，羊毛甾醇14α-脫甲基化是其中的關鍵步驟，該步驟需要由底物專一的CYP51 催化完成[17]。CYP51 含有一個血紅素-鐵活性中心，其鐵原子與氧氣結合后以高價鐵形式存在，形成鐵卟啉氧結合物，獲得較強的氧化能力，催化24-亞甲基二氫羊毛甾醇形成去甲基羊毛甾醇，CYP51 提高了14α-脫甲基化反應效率[18-20]。此反應包括以下4 步：14α甲基被氧化為14α羥甲基；14α羥甲基被氧化為14α甲酰基；14α甲酰基被氧化為14α甲酰氧基；14α甲酰氧基以甲酸形式失去14α甲酰氧基和15α氫，形成碳碳雙鍵 (圖1)[21]。

圖1 CYP51 催化的羊毛甾醇14α-脫甲基化反應[21]Fig. 1 The 14α-demethylation mechanism of lanosterol catalyzed by CYP51[21]

DMI 類殺菌劑雜環上的氮原子具有孤對電子，能與病原真菌中CYP51 的血紅素-鐵活性中心的鐵原子以配位鍵結合，形成鐵卟啉中心的配位絡合物，導致氧原子與CYP51 結合減少，CYP51氧化催化能力受到抑制，致使14α-脫甲基化反應受阻，從而干擾真菌麥角甾醇的合成[22-24]。一方面，麥角甾醇缺失可導致細胞膜結構及功能異常，使膜鍵與酶活性發生變化，真菌細胞易受損傷，甚至會造成麥角甾醇類激素激活功能紊亂，影響細胞生長增殖[25-26]；另一方面，14α-去甲基化反應受阻可引起24-亞甲基二氫羊毛甾醇大量積累，抑制真菌細胞膜流動[27]。

2 抗性分子機制

2.1 CYP51 氨基酸突變

CYP51 氨基酸突變是植物病原真菌中報道最為廣泛的抗性機制。CYP51基因在殺菌劑的長期選擇下發生單個或多個堿基突變，導致氨基酸序列發生替換，從而引起CYP51 的結構與空間構象發生改變，使得CYP51 與殺菌劑的結合能力下降，真菌對藥劑的敏感性降低導致抗藥性產生。許多植物病原菌如小麥葉枯病菌Mycosphaerella graminicola[28]、小麥白粉病菌Blumeria gramini[29]、香蕉黑條葉斑病菌Mycosphaerella fijiensis和小麥葉銹病菌Puccinia triticina[11]對DMI 類殺菌劑的抗性均是由CYP51 氨基酸點突變引起 (表1)，其中小麥葉枯病菌對該類殺菌劑產生抗性的氨基酸替代和缺失多達30 種。

表1 CYP51 氨基酸改變導致植物病原菌對DMI 類殺菌劑產生抗性Table 1 Amino acid alterations within CYP51 in plant pathogens are responsible for DMI fungicides resistance

隨著三唑類殺菌劑在許多真菌病害防治中的應用，真菌中CYP51基因迅速進化。在植物病原菌中，CYP51 廣泛存在的突變類型為Y136F，即其136 位酪氨酸被取代為了苯丙氨酸，該突變位點在許多病原菌的抗性菌株中均有報道，與小麥白粉病菌、葡萄白粉病菌Erysiphe necator和香蕉黑條葉斑病菌對唑類殺菌劑的抗性有關[45]；在小麥葉枯病菌M. graminicola中表現為Y137F 突變[28]，在Parastagonospora nodorum中表現為Y144F/H突變[42]。油菜核盤菌Sclerotinia sclerotiorum經室內馴化獲得了對戊唑醇的低抗菌株，其中CYP51第244 位賴氨酸突變為谷氨酸 (K244E)[43]；在指狀青霉P. digitatum中亦存在對咪鮮胺產生抗性的K253E 突變菌株[40]；大麥網斑病菌P. teresF489L突變菌株對戊唑醇的敏感性降低[15]，與大豆疫霉P. pachyrhiziF120L 氨基酸替代[41]、煙曲霉Aspergillus fumigatusCYP51A 中的F495I[46]和指狀青霉菌CYP51B 中的F506I 可能屬于同源突變[46-47]。此外，許多氨基酸單突變可引起病原菌產生抗藥性的同時，也極易導致菌體死亡，如I381V 突變可導致小麥葉枯病菌對三唑類藥物的敏感性降低，同時該突變也會破壞CYP51 功能，影響菌體活性；然而當I381V 與ΔY459/Y461H 同時發生突變時，菌株CYP51 的活性和功能將得以恢復[47]。

關于上述氨基酸突變引起病原菌抗藥性的原因，許多學者進行了研究和解析。氨基酸替代可引起CYP51 結合腔體積及內部結構發生變化，進而干擾藥劑與靶蛋白的相互作用，削弱藥劑對病原菌的抑制活性。通過對小麥葉枯病菌 CYP51 與三唑類殺菌劑分子對接模型的研究發現，野生型CYP51 中 Y137 位于血紅素-鐵活性中心，氨基酸替代 (Y137F) 可使結合腔體積增大至野生型的兩倍以上，F137 比Y137 的位置更接近與之對接的唑類藥劑，但由于F137 位于血紅素-鐵活性中心堵塞位置，故與三唑醇的結合受阻。血紅素活性中心的其他結合位點不受Y137F 約束，該氨基酸突變所引起的羥基丟失，可能導致對戊唑醇、氟環唑、咪鮮胺的敏感性下降 (圖2)[48]。小麥葉枯病菌I381V 減小了CYP51 結合腔體積，導致Y137和459～461 氨基酸片段更靠近與之對接的唑類藥劑，同時在此范圍內相互作用的氨基酸增多，這可能是I381V 在缺乏其他氨基酸突變情況下，影響CYP51 活性和功能的重要原因[36]。

圖2 不同類型小麥葉枯病菌CYP51 與三唑類藥劑分子對接模型[48]Fig. 2 Azole docking with different CYP51 proteins in Mycosphaerella graminicola[48]

氨基酸替代可導致CYP51 構象發生重排，從而引起蛋白質的結構缺失或方向改變，進而削弱藥劑對病原菌的抑制活性。小麥葉枯病菌S524T改變了CYP51 蛋白β-轉角的方向，可能是由于T524 導致不同作用模式的氫鍵改變了肽鏈方向，破壞蛋白質核心區域β折疊股的排列，引起β1-折疊、β2-折疊丟失，盡管β3-折疊沒有完全丟失，但它的空間構象也與野生型蛋白有明顯的不同[48-49]。大麥網斑病菌F489L 突變導致了CYP51 結合腔內構象重排，使靶蛋白與戊康唑、苯醚甲環唑、咪鮮胺的結合力降低[41]。

氨基酸突變能引起藥劑與靶蛋白結合位點發生變化，導致藥劑與靶蛋白親合力改變。由膠孢炭疽菌C. gloeosporioides與戊唑醇的分子對接模型可以看出，氨基酸突變可引起同源蛋白CYP51s 與戊唑醇結合位點的改變，同時結合形成的氫鍵數量也有所變化，與敏感菌株相比，抗性菌株CYP51s 與戊唑醇的結合力降低[30]。水稻惡苗病菌Fusarium fujikuroiS312T 點突變后，CYP51B 蛋白的K148 和 I471 與咪鮮胺形成兩個氫鍵，而在野生型菌株中，藥劑與CYP51B的相互作用則是通過Y137 和H468 實現的。突變后，CYP51B 蛋白與咪鮮胺的親和力增加，表明抗性菌株中可能有其他抗藥性機制存在，也可能源于S312T 點突變是咪鮮胺在病原菌中的耐藥靶點，并非毒理學靶點[32]。

盡管有些氨基酸不會與DMI 藥劑直接結合，但其發生突變后也能間接影響靶標與藥劑間的相互作用。通過構建大豆疫霉CYP51 同源蛋白模型，Schmitz 等發現，盡管K142R、I145F 和I475T氨基酸突變不與DMI 類殺菌劑直接結合，但可通過改變血紅素活性中心的空間結構而間接影響CYP51 與DMI 藥劑的結合，特別是I475T 突變可能導致蛋白質構象發生改變，這種改變通過鄰近的C474 可間接影響血紅素活性中心與藥劑間的相互作用[50]。此外，他們還發現，血紅素構象的改變可能會影響CYP51 的功能[50]。

2.2 CYP51 基因過表達

基因過表達可使病原菌體內產生更多的CYP51蛋白。在藥劑與靶標酶結合后，14α-去甲基化酶活性降低，而CYP51基因過表達會促使菌體內仍有足夠的活性較高的去甲基化酶維持菌體內正常的生理活動，從而導致抗藥性的產生。在蘋果黑星病菌V. inaequalisCYP51基因啟動子區域插入一段長度為553 bp 的基因片段會導致靶基因過表達，從而引起病原菌對腈菌唑敏感性降低[50]。在桃褐腐病菌Monilinia fructicola中CYP51基因啟動子區域115 bp 處插入一段65 bp 的轉座子Mona，降低了菌株對DMI 類藥劑的敏感性，并基于一系列基因敲除試驗，證實Mona 中一段20 bp的核心序列是啟動子驅動基因過表達的關鍵[51]。香蕉黑條葉斑病菌對丙環唑、苯醚甲環唑的敏感性降低，啟動子分析顯示，在抗性菌株PfCYP51啟動子區域94 bp 位置插入了一段長度為103 bp的基因片段，引起基因表達上調[52](表2)。在小麥葉枯病菌CYP51啟動子區域插入一段長度為120 bp的基因片段，引起靶基因表達量上升，該插入片段與11 號染色體上一個功能未知的預測基因5′端相似，這一發現表明小麥葉枯病菌存在基因組重組現象，而且，隨著CYP51基因過表達機制出現頻率的大幅提高，表明攜帶CYP51基因過表達機制的突變菌株可能在物種進化方面存在較強優勢[53]。

表2 CYP51 基因過表達導致植物病原菌對DMI 類殺菌劑產生抗性Table 2 Overexpression of CYP51 in plant pathogens is responsible for to DMI fungicides resistance

續表2Table 2 (Continued)

某些病原菌存在CYP51 同源蛋白，不同的CYP51基因過表達機制中存在不同的插入片段，其突變菌株在基因表達、穩定性方面也有所差異。指狀青霉CYP51A上游序列存在5 個126 bp 的串聯重復序列，導致CYP51A過表達[56]。此外，在126 bp處的轉錄增強子中插入一段長度為199 bp 的基因片段，可導致CYP51A的表達進一步升高 (圖3)[57]。研究發現，在CYP51B啟動子區域插入長度為199 bp或195 bp 的基因片段，均能引起靶基因表達上調，并與其對DMI 類殺菌劑產生抗性有關，插入的195 bp 基因片段除了缺少4 個核苷酸外，與插入的長度為199 bp 的基因片段序列一致，推測該序列作為MITE 轉座元件(PdMLE) 調控下游基因表達[58,62]；進一步研究發現，在CYP51B啟動子區域插入一段長度為195 bp 的基因片段，其序列比CYP51A的5 個126 bp 串聯重復序列更穩定，隨著195 bp 增強子在CYP51B啟動子區域的引入，促使CYP51A啟動子126 bp 串聯重復序列丟失，使突變菌株在獲得對DMI 類殺菌劑抗性的同時增強了病原菌的侵染能力[58,63]。

圖3 指狀青霉PdCYP151 啟動子區域示意圖[57]Fig. 3 A schematic diagram of the promoter region of the PdCYP51 gene in Penicillium digitatum[57]

病原菌對DMI 類藥劑的抗性水平也與啟動子區域插入序列的位置有關，不同位置插入的序列可引起菌株對藥劑的敏感性差異。在大麥網斑病菌CYP51A上游調控區5 個不同位置發現了長度為134 bp 的插入序列，啟動子分析結果表明，所有134 bp 插入元件均含有相同的啟動子序列，表明ty1-copia 類LTR 逆轉錄轉座子可能存在多個離散轉座。該插入序列引起CYP51基因轉錄活性增強，但序列所在的不同位置引起病原菌對藥劑的抗性水平也有所差異，CYP51A啟動子區域存在兩種不同表型，轉座元件位于起始密碼子 ?66、?74 或 ?75 bp 處，菌株表現中水平抗性；轉座元件位于起始密碼子 ?46 或 ?90 bp 處，菌株則表現出高水平抗性[15]。

此外，轉錄因子的調控在CYP51過表達中發揮了不可缺少的作用。通過突變體庫篩選、同源基因克隆等手段，植物病原真菌對DMI 類殺菌劑抗性相關轉錄因子的研究也取得初步進展。研究發現，指狀青霉中PdsreA 和PdsreB 介導的轉錄調控機制可影響CYP51基因表達，參與調控麥角甾醇合成，從而降低病原菌對DMI 類殺菌劑的敏感性[64]；PdCYP51A和PdCYP51B基因表達也受到轉錄因子PdSte12 的正向調控，從而影響病原菌對DMI 殺菌劑的抗性[65]。禾谷鐮刀菌F.graminearum抗性相關元件FgTeb 可以和FgCYP51A基因啟動子結合，調控CYP51A基因表達，進而控制禾谷鐮刀菌對DMI 類殺菌劑的敏感性，在FgTeb 敲除突變體中，CYP51A基因表達量降低，菌株對戊唑醇、三唑酮表現敏感[66]；禾谷鐮刀菌中轉錄元件FgSR 被FgSsk2-FgPbs2-FgHog1 復合物激活，與SWI/SNF 復合物相互作用，增強CYP51s轉錄活性[10]。在麥角甾醇合成途徑中，轉錄因子可以與多個基因的啟動子區域結合，調控多個基因表達。

2.3 外排蛋白編碼基因過表達

轉運蛋白具有轉運有毒化合物的功能，包括次生代謝物、抗生素、殺菌劑等，藥劑外排可以有效降低藥劑在菌體內的積累量，對抗性菌株的分析表明，外排蛋白過表達一般伴隨著菌株的多藥抗性[67-69]。

2.3.1 A B C 轉運蛋白編碼基因過表達ABC（ATP-binding cassette）轉運蛋白在細胞膜上呈鑲嵌狀排列，通常由跨膜結構域 (TMD) 和核苷酸結合結構域 (NBD) 組成。NBD 可以結合并水解ATP，為藥劑排出提供能量；TMD 由6 個跨膜結構組成，與NBD 由環狀保護結構彼此相連。NBD 上的核苷酸結合位點可以通過與ATP 結合并水解產生能量，隨后TMD跨膜結構發生變化，與藥劑的結合位點得以顯露，在與藥劑結合后完成跨膜外排[70-72]。ABC 轉運蛋白跨膜結構域上轉運藥劑的結合位點十分復雜，其活性位點上存在大量的芳香族殘基。研究發現，疏水性強、有明顯芳香性結構并且分支豐富的化合物更容易與活性位點結合[73-74]。在A B C 轉運蛋白家族中，PMR1 類型的Pdr5p 蛋白是植物真菌中主要的藥劑外排泵，該蛋白的過度表達可導致植物病原菌對DMI 類殺菌劑產生抗性[75]。

ABC 轉運蛋白控制的能量依賴型藥劑排出機制在構巢曲霉Aspergillus nidulans、指狀青霉、灰葡萄孢Botrytis cinerea、禾谷鐮刀菌等植物病原菌中均有報道。20 世紀90 年代，Sorbo 從構巢曲霉中首次克隆了ABC 轉運蛋白家族中的atrA和atrB基因，并將atrB基因轉入PDR5基因缺失的酵母菌株中，利用三唑類藥劑處理菌株，發現atrA和atrB基因在幾分鐘內表達量升高，菌株對三唑類藥劑的敏感性降低，說明atrA和atrB基因在調控藥劑外排中發揮了重要作用[76]。研究發現，atrB基因過表達可引起菌株對多類藥劑產生抗性，構巢曲霉atrB基因過表達表現出對苯并咪唑類、三唑類以及一些植物源化合物的敏感性降低，該基因表達量與對藥劑敏感性呈負相關；相反地，atrB基因缺失則可引起菌株對上述藥劑敏感性增加[77]。隨后，構巢曲霉atrC和atrD基因被證明與病原菌多藥抗性有關，而且還參與菌體代謝產物的分泌[78]。禾谷鐮刀菌ABC 轉運蛋白結構域與MDR 型蛋白相關，與白色念珠菌Candida albicans、釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae的PDR 型蛋白高度相似，經戊唑醇處理后，菌株耐藥性增強，在編碼ABC 轉運蛋白的54 個基因中，有15 個基因表達量上調兩倍以上，而將FgABC3和FgABC4基因敲除后，其對DMI 類殺菌劑的敏感性增強；FgABC1和FgABC3缺失的突變菌株對小麥、大麥和玉米的侵染力有所降低，系統發育分析表明，FgABC1可能負責真菌次生代謝產物的分泌，減輕宿主的防御功能，FgABC3基因可能編碼宿主來源的抗真菌分子的轉運蛋白[79-80]。在指狀青霉ABC 轉運蛋白家族中，PMR1 蛋白過表達可引起菌株對DMI 類殺菌劑產生抗性的同時，也會導致其對環己酰亞胺的耐受性增強，后續研究發現，PMR5 蛋白的過度表達也與菌株多藥抗性相關，但PMR1 和PMR5 所受的誘導調控機制不同，PMR1 蛋白的過量表達受到DMI 類藥劑特異性誘導，而PMR5 蛋白的過量表達則受到白藜蘆醇和二氰蒽醌的誘導[81-85]。灰葡萄孢對DMI 類殺菌劑的抗性與BcatrB、BcatrD編碼基因密切相關，BcatrB過表達與轉錄因子突變有關，由于轉錄因子 Mrr1 發生激活突變，導致轉錄因子與啟動子結合異常，致使BcatrB基因轉錄效率提高，從而引起菌株對戊唑醇等多種殺菌劑產生抗性[83]；BcatrD基因缺失導致菌株對DMI 類殺菌劑的敏感性增強；BcatrD基因過度表達，菌株敏感性降低，表達量與抗性水平呈正相關[84]。此外，利用氯丙嗪(chlorpromazine) 外排抑制劑處理BcatrD基因過表達突變體，可有效增加三唑類藥劑在菌體中的積累量，進一步說明BcatrD基因參與了藥劑跨膜外排，其過表達可引起藥劑在菌體內積累量增多[85]。

2.3.2 MFS 轉運蛋白編碼基因過表達 雖然MFS（major facilitator superfamily）轉運蛋白缺少可水解ATP 的NBD 結構，但其可利用質子電化學梯度勢實現對藥劑的運輸和外排。與ABC 轉運蛋白相同的是，MFS 轉運蛋白中TMD 結構作為底物結合位點，與藥劑結合后實現跨膜外排[86]。根據TMD 中跨膜區(TMs)數量，MFS 轉運蛋白可以分為DHA1 亞型和DHA2亞型。DHA1 亞型含有12 個跨膜區 (transmembraneahelices,TMs)，由環狀親水結構相連，其氨基端和羧基端位于細胞質內，羧基端TMs7～TMs12同源性高于氨基端TMs1～TMs6。DHA2 亞型由14 個TMs 組成，TMs1～TMs12 的結構特點與DHA1 亞型一致，所不同的是，D H A 2 亞型轉運蛋白TMs13～TMs14 是利用導入細胞質環的方式插入細胞質中[87-89]。

Hayashi 等從灰葡萄孢中克隆了MFS 蛋白家族中的Bcmfs1基因，發現其過表達突變體對DMI 藥劑的敏感性降低[90]；隨后，Kretschmer等又發現了Bcmfs2基因，該基因表達量與藥劑外排顯著相關[83]。當在Bcmfs2啟動子區域插入一段長度為1326 bp 的序列時，可引起啟動子區序列重排，導致丟失一段長度為678 bp 的序列，進而引起Bcmfs2過表達，該插入序列可能為LTR-逆轉錄轉座子[91]。指狀青霉中PdMfs1、PdMfs2 轉運蛋白與菌株抗藥性顯著相關，通過利用基因敲除和異源表達等手段，發現PdMfs1在菌株對咪鮮胺、抑霉唑抗性方面發揮重要作用[92-93]；指狀青霉對咪鮮胺的耐藥性也與PdMfs2 轉運蛋白密切相關，PdMfs2基因過表達可導致菌株對咪鮮胺敏感性降低[94]。此外，指狀青霉經咪鮮胺處理后，7 個不同的MFS 轉運蛋白表達量上調，這可能是同一MFS 家族的不同蛋白可實現相同功能[95]。PdMfs1缺失的突變體并未顯著增加其對所有DMI 類殺菌劑的敏感性，推測在沒有特定的MFS 轉運蛋白的情況下，其他轉運蛋白可替代其功能[92]。研究發現，小麥葉枯病菌中Mgmfs1 轉運蛋白在抗藥性方面發揮了重要作用，其過表達可引起菌株對氟環唑、戊唑醇和丙硫菌唑敏感性降低[41]。通過研究不同敏感型小麥葉枯病菌發現，Mgmfs1在多種轉運蛋白中表達量最高，這與啟動子區域插入一段長度為519 bp 的基因片段有關[96]。此外，在位于Mgmfs起始密碼子-194 bp 位置插入一段長度為1884 bp 的基因片段，導致Mgmfs基因表達上調，引起小麥葉枯病菌產生抗藥性[97]。

3 問題及展望

DMI 類殺菌劑具有殺菌譜廣、藥效高、持效期長等特點，在防治植物病原菌中發揮了重要作用，但由于DMI 類殺菌劑作用位點單一，導致許多重要病原菌對其產生抗性。而有關其抗性機制較為復雜，很可能是多種機制聯合作用的結果，深入了解病原菌對DMI 類殺菌劑抗性機制，有助于采取相應措施合理解決菌株抗性問題。

氨基酸點突變是引起菌株抗性的關鍵因素，對于抗性機制的研究，除了明確與抗性相關的有效突變，也要關注氨基酸突變后對于蛋白質活性及結構、與藥劑間相互作用、甾醇合成途徑的影響。隨著分子生物學的進一步發展，有關殺菌劑的靶標研究會逐步完善，明確與抗性相關的有效基因，通過蛋白質結構生物學解析、分子對接等方法的建立和優化，明確靶蛋白的空間結構，與藥劑的結合位點以及二者間的相互作用，進一步解析野生型和突變型CYP51 與藥劑間的結合差異，為化合物的結構修飾與優化提供參考和思路，進而設計出更多安全、有效的新型殺菌劑，從根本上解決菌株抗藥性問題。

基因的表達離不開啟動子與轉錄因子的調控，許多研究指出CYP51 過表達與啟動子區域插入的基因序列密切相關，但對于該插入序列的來源、功能、與轉錄因子間的相互作用尚未明確。轉錄因子構成復雜的調控網絡，暗示著抗性調控的復雜性，目前與轉錄因子相關的抗藥性研究大多集中在模式真菌中，釀酒酵母Upc2 含有N 端鋅指結構 (zinc finger domain) 和典型的C 端配體結合結構域 (ligand binding domain, LBD)，該配體結合結構域可直接與麥角甾醇結合，感知細胞中的麥角甾醇，進而調節麥角甾醇的生物合成。當與麥角固醇結合時，Upc2 形成非激活構象，抑制其核定位序列(NLS) 功能，從而保留在細胞質中。在麥角固醇缺失的條件下，Upc2 從麥角甾醇中解離，并易位到細胞核中，轉錄激活麥角甾醇合成的相關基因[98]。Upc2 C 末端的突變會破壞與麥角甾醇的結合，增強其轉錄活性，從而導致對DMI 類殺菌劑的抗性[99-100]。然而，由于植物病原菌與酵母類真菌同源性較低，有關轉錄調控的研究非常有限，已鑒定出的轉錄因子、轉錄調控途徑甚少。此外，在麥角甾醇合成途徑中，轉錄因子可與多個基因的啟動子結合，調控多個基因表達[66]，因此研究菌株CYP51 基因表達機制，明確敏感及抗性菌株啟動子與轉錄因子的差異性、二者間的相互作用以及轉錄調控途徑，進而以轉錄因子為切入點，設計新型靶標抑制劑，協同DMI類殺菌劑提高防治效果，延緩并解決病原菌抗性問題。許多重要的調控元件如Hsp90 可以通過鈣調磷酸酶 (Calcineurin) 調控釀酒酵母、白色念珠菌對唑類藥劑的抗藥性，抑制Hsp90 可明顯提高唑類等多種抗真菌藥劑的治療效果[101-102]，由于Hsp90 與多種蛋白具有相互作用，參與多種基因調控途徑，醫學上Hsp90 抑制劑已應用于癌癥治療中，但目前尚未發現用于防治真菌的調控因子抑制劑[101,103-104]。

在某些情況下，病原菌對DMI 類殺菌劑的抗性也源于外排蛋白表達量升高，目前對于植物病原菌抗性相關的外排蛋白研究有限，調控外排蛋白基因表達機制尚未明確，植物病原菌中灰葡萄孢B. cinerea、小麥葉枯病菌有所報道，在灰葡萄孢中表現為通過轉錄因子激活突變調控BcatrB基因表達；在小麥葉枯病菌中表現為啟動子區域存在插入序列引起Mgmfs1表達上調。真菌外排蛋白的表達主要由鋅指類轉錄因子 (TFs [Zn2Cys6]) 進行調控[105]，關于調控外排蛋白基因表達機制的研究已在白色念珠菌和釀酒酵母中有所進展，白色念珠菌ABC 編碼基因受Tac1p、Upc2、Fcr3p、Cap1p 轉錄因子正向調控，其中Tac1p、Upc2 轉錄因子可與基因啟動子區域直接結合[106-110]；Mrr1p轉錄因子的功能獲得性突變可引起MFS 編碼基因過表達[111]。釀酒酵母中Stb5p、Pdr1p、Pdr3p 轉錄因子正向調控ABC 基因表達，Stb5p 與Pdr1p形成異二聚體直接與啟動子區域結合[112-113]；MFS基因表達受Yap1、Msn2、Msn4 和Sfp1 等脅迫相關轉錄因子的調控[114]。由于病原菌外排蛋白能夠主動地將藥劑排出體外，且受多種調控機制影響導致基因表達上調，菌體內外排蛋白數量增多，影響藥劑在菌體內的積累量，因此篩選出有效控制病原菌外排的抑制劑，包括轉運蛋白抑制劑、ATP 酶活性抑制劑，聯合應用DMI 類殺菌劑，增加藥劑在菌體內積累，對于病原菌抗性治理至關重要。已有研究發現，鈣通道阻滯劑維拉帕米(verapamil)能有效抑制MFS 轉運蛋白BcmfsM2，氯丙嗪 (chlorpromazine) 是灰葡萄孢ABC 轉運蛋白BcatrD 抑制劑，與咪唑具有協同增效作用[85,91]。

植物病原真菌的抗藥性機制仍需進一步加強，尤其對于抗藥性相關基因的表達調控機制，在植物病原菌中研究十分有限，主要集中在釀酒酵母、白色念珠菌中，但由于植物病原菌與上述真菌調控因子同源性較低，且調控體系更為復雜，故可提供的指導意義有限。許多研究采用遺傳體系相對簡單的模式真菌開展抗藥性基因篩選工作，例如粗糙脈孢菌Neurospora crassa、構巢曲霉等，初步確定其抗藥性機制后，在病原菌中進行功能驗證。此外，多種組學聯用、藥效基團模型建立、蛋白質結構解析等方法也可以引入抗藥性研究中，提高研究效率，加強對抗藥性機制的深入了解，以此為切入點，從根本上克服菌株抗性問題。