致病疫霉對纈菌胺敏感基線的建立及抗性風險評估

楊 坡, 吳 杰, 路 粉, 趙建江, 畢秋艷,韓秀英, 李 洋, 王文橋*,

(1. 河北農業大學 植物保護學院，河北 保定 071000；2. 河北省農林科學院 植物保護研究所，河北 保定 071000)

由致病疫霉Phytophthora infestans(Mont.) de Bary 引起的馬鈴薯及番茄晚疫病為多循環氣傳病害，發生范圍廣，流行速度快，短期內可造成重大損失，嚴重影響了馬鈴薯和番茄的生產[1]。化學防治作為重要的防治手段，防效高，見效快，已成為晚疫病的主要防治手段，被廣泛應用。自20 世紀70 年代末以來，苯基酰胺類殺菌劑 (甲霜靈、精甲霜靈、霜靈) 、羧酸酰胺類殺菌劑 (烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺、氟嗎啉、纈霉威等) 、QoI類殺菌劑(嘧菌酯、吡唑醚菌酯、啶氧菌酯等) 、氰基乙酰類 (霜脲氰) 、吡啶酰胺類 (氟吡菌胺) 和哌啶基噻唑異唑啉類 (氟噻唑吡乙酮) 等一批高效、內吸殺菌劑及其混劑被應用于晚疫病的防治，使晚疫病的防治水平大大提高，但隨著內吸性殺菌劑的大量使用，一些國家相繼報道了包括致病疫霉對甲霜靈的抗性[2-8]和對嘧菌酯的抗性[9]，導致出現相應藥劑防效明顯降低、病害再猖獗、農產品中農藥殘留超標等現象，嚴重影響農產品品質。如今抗藥性已成為晚疫病化學防治中的重要問題之一。

殺菌劑抗性風險是指隨著病原菌抗藥性的發展，存在殺菌劑防病失敗或藥效降低的可能性。抗性風險由病菌生物與遺傳特性及藥劑作用機制與作用特點決定的基本風險和藥劑的使用對策形成的治理風險組成[10]，是制訂抗藥性治理對策和開發應用殺菌劑的重要依據[11]。纈菌胺是2008 年研發的羧酸酰胺類殺菌劑，可有效防治由卵菌中除腐霉屬之外的病原菌引起的局部或系統性侵染病害[12]。66%代森錳鋅 ? 纈菌胺水分散粒劑已在中國登記用于防治馬鈴薯晚疫病，目前尚未見有關致病疫霉對纈菌胺的抗性風險的研究報道。

本研究通過建立致病疫霉對纈菌胺的敏感基線，篩選致病疫霉對纈菌胺的抗性突變菌株，研究纈菌胺與現用的其他羧酸酰胺類殺菌劑及非羧酸酰胺類殺菌劑之間的交互抗性，旨在為監測致病疫霉對纈菌胺抗性的發生發展提供參考，為明確致病疫霉對纈菌胺的抗性風險、制定致病疫霉對纈菌胺的抗性治理策略及晚疫病高效化學防治方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試培養基及藥劑 黑麥蔗糖瓊脂培養基(rye sucrose agar，RSA)：黑麥80 g，瓊脂15 g，蔗糖20 g，蒸餾水定容至1 L。利福平(rifampicin)，索萊寶(CAS：13292-46-1)；氨芐西林鈉 (ampicillin)，索萊寶(CAS：69-52-3)；95%五氯硝基苯(quintozene)原藥，山西三立化工有限公司；98%多菌靈 (polymyxin) 原藥，河北冠龍農化有限公司。

1.1.2 供試菌株 于2018 年從河北省、內蒙古自治區、黑龍江省、貴州省和四川省未使用過纈菌胺，且鮮用其他羧酸酰胺類殺菌劑防治晚疫病的馬鈴薯主產區，采集具有晚疫病典型癥狀的新鮮病葉。每個省 (自治區) 選2～3 個市(縣)，每個市(縣)選擇3～5 個馬鈴薯集中種植區，每個種植區至少間隔10 km，從5 個不同的地塊采集20～40 個病樣 (表1)。

表1 供試菌株采集時間及地點Table 1 Collection time and location of the tested strains

剪取病葉病健交界處，分別夾于健康、感病的馬鈴薯薯塊切口中，置于保溫箱內。將馬鈴薯薯塊置于滅菌的、底部鋪有濕濾紙的培養皿中的一次性筷子上，并在18 ℃培養箱中黑暗培養至薯塊切口邊緣長出白色菌絲 (視情況可將健康馬鈴薯薯塊轉接多次)。挑取菌絲轉接到選擇性黑麥蔗糖瓊脂培養基平板 (RSA 中加入50 μg/mL 利福平、50 μg/mL 氨芐西林鈉、50 μg/mL 五氯硝基苯和50 μg/mL 多菌靈) 上，18 ℃黑暗條件下培養7～10 d。挑取培養后的菌絲塊，置于載玻片上鏡檢觀察。接種感病馬鈴薯葉片，再分離，完成柯赫氏法則檢驗。將具有致病疫霉的典型特征的菌株保存在RSA 斜面上或平板上待試。共獲得105 個致病疫霉菌株，用于測定對纈菌胺的敏感性。

1.1.3 供試藥劑 98% 纈菌胺(valifenalate) 原藥，江蘇省蘇州富美實植物保護劑有限公司；95%雙炔酰菌胺(mandipropamid)原藥，先正達作物保護有限公司；97.6%烯酰嗎啉(dimethomorph)原藥，河北冠龍農化有限公司；95% 嘧菌酯(azoxystrobin)原藥，南京金土地化工有限公司；95%氟吡菌胺(fluopicolide)原藥，拜耳作物科學公司；98%霜脲氰(cymoxanil)原藥，杜邦公司；97%甲霜靈 (metalaxyl)原藥，沈陽化工研究院。

1.2 試驗方法

1.2.1 致病疫霉對纈菌胺敏感性測定 采用菌絲生長速率法[13]測定。以二甲基亞砜為溶劑，配制質量濃度為1000 mg/L 的纈菌胺母液，用無菌水將母液依次稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156 和0.078 mg/L 藥液。準確移取6 mL 不同濃度藥液，分別添加到事先滅菌并冷卻至50～54 ℃的54 mL RSA 培養基中，之后倒入直徑9 cm 的培養皿中，制成系列質量濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.0156 和0.0078 mg/L的含纈菌胺的RSA 平板。對照組添加相同質量濃度的二甲基亞砜和等量的無菌水，制成不含藥劑的RSA 平板。

將分離純化的致病疫霉菌株接種在不含藥劑的RSA 平板上，于18 ℃黑暗條件下培養至菌落長滿平板。在菌落邊緣打取直徑0.5 cm 的菌餅，轉移至含有不同質量濃度纈菌胺的RSA 平板中央。每濃度和對照組平板各重復3 次，于18 ℃下黑暗培養7～10 d。當無菌水對照平板菌落長滿培養皿時，采用十字交叉法測量各處理菌落直徑，按 (1) 式計算各藥劑對菌絲生長的抑制率。

式中：I為抑制率，%；D0為對照組菌落生長直徑，mm；Dt為處理組菌落生長直徑，mm。

以藥劑質量濃度的對數 (x) 為橫坐標，抑制率轉換成對應的機率值 (y) 為縱坐標，求出纈菌胺對供試菌株的毒力回歸方程y= bx+a，計算抑制菌落生長的有效中濃度(EC50)及相關系數。

1.2.2 致病疫霉對纈菌胺敏感基線的建立 參照DBl3/T 1420—2011《馬鈴薯晚疫病菌抗藥性檢測技術規程》的方法[13]，將供試菌株對纈菌胺的敏感性(EC50值)劃分成5 個區段，以每個區段菌株出現的頻率 (%) 為縱坐標，以藥劑濃度區段為橫坐標，畫出菌株敏感性分布光滑曲線圖，由5 個點連成，每一點以(x, y)來表示，x= 濃度區段中值，y代表該區段菌株出現頻率。利用 SPSS 統計軟件進行不同區段菌株頻率數據正態性分布檢驗，如果Ρ> 0.05，即在95%置信限內，敏感性呈近似正態分布，則菌株可視為野生敏感菌株，其敏感性(EC50)平均值可作為敏感基線(EC50值)，計算結果保留小數點后3 位數字。

1.2.3 致病疫霉對纈菌胺抗性突變體的獲得

1.2.3.1 紫外誘變菌絲體 將野生敏感菌株接種在不含藥劑的RSA 平板上，在黑暗、18 ℃條件下培養7～10 d，待菌落長滿平板后，置于紫外燈(15 W，254 nm，預熱 30 min) 下方垂直距離25 cm 處，分別照射10、15、20、25、30 和35 min。每個時間點照射完成后，在黑暗條件下培養至少30 min。在無菌紅光條件下打取直徑5 mm 菌塊，菌絲面向下接種到不含藥劑的RSA 平板。每處理10 皿，每皿4 塊。在黑暗、18 ℃下培養7～10 d，采用十字交叉法測量菌落直徑。觀察菌落生長情況，確定照射亞致死時間。

將野生敏感菌株接種在不含藥劑的RSA 平板上，在黑暗、18 ℃條件下培養7～10 d，待菌落長滿平板后，接種到含1、0.5、0.25、0.125、0.0625 和0.03125 mg/L 纈菌胺的RSA 平板及對照平板上，在黑暗、18 ℃下培養7～10 d后觀察菌絲生長情況，確定藥劑最低抑制質量濃度(MIC，0.5 mg/L)。

參考趙衛松[14]的方法，先在黑暗無菌條件下，將一批長滿敏感菌株的平板置于紫外燈 (15 W，254 nm，預熱 30 min) 下方垂直距離25 cm 處照射30 min，再在黑暗條件下培養至少30 min。在無菌紅光條件下從菌落邊緣切取大小為10 mm ×10 mm 的菌塊，菌絲面向下接種至含MIC 或以上濃度纈菌胺的RSA 平板上。每皿4 塊，在黑暗、18 ℃條件下培養7～10 d，觀察菌塊菌絲生長情況。若能在含MIC 及以上濃度纈菌胺的RSA 平板上生長，表明該野生敏感菌株對纈菌胺產生了抗性。按公式 (2) 計算抗性突變頻率。

式中：MR1為紫外誘變菌絲體的抗性突變率；NR為出現抗性突變的菌餅數；NT為供試的菌餅總數。

1.2.3.2 紫外誘變孢子囊 將野生敏感菌株接種在RSA 平板上，在黑暗、18 ℃條件下培養15 d后，用無菌水洗下孢子囊，用雙層紗布過濾，在顯微鏡下調孢子囊濃度至 5 × 105個/mL。在無菌條件下，取上述孢子囊懸浮液5 mL 置于距紫外燈(15 W，254 nm，預熱 30 min) 下方垂直距離25 cm處，邊振蕩邊分別照射30、60、90、120、150 和180 s。每個時間點照射完成后，再在黑暗條件下培養至少30 min。在無菌紅光條件下均勻涂布在不含藥劑的R S A 平板上，每個時間點接種10 皿，每皿10 μL，觀察菌落生長情況及疏密程度，確定紫外線照射孢子囊亞致死時間。

參照Van Tyul 的方法[15]，在無菌條件下，取上述孢子囊懸浮液5 mL，置于距紫外燈 (15 W，254 nm，預熱 30 min) 下方垂直距離25 cm 處，邊振蕩邊照射120 s 后，在黑暗條件下培養30 min。在無菌紅光條件下均勻涂布在含MIC 及以上濃度纈菌胺的RSA 平板上，每菌株接種10 皿，每皿10 μL，于黑暗、18 ℃條件下培養7～10 d。若能在含MIC 及以上濃度纈菌胺的RSA 平板上長出菌絲，表明該野生敏感菌株對纈菌胺產生了抗性，按公式 (3) 計算突變頻率。

式中：MR2為紫外誘變孢子囊的抗性突變率；NSR為出現抗性突變菌株孢子囊數；NST受紫外線照射的孢子囊總數。

1.2.3.3 藥劑馴化 將野生敏感菌株分別接種到含0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 和1.0 mg/L 纈菌胺的RSA 平板上，于黑暗、18 ℃條件下培養7～10 d，觀察平板上菌絲生長情況，確定纈菌胺對親本敏感菌株GZGY 的亞致死質量濃度為0.4 mg/L，MIC 為0.5 mg/L，對親本敏感菌株CFKLQ 的亞致死質量濃度為0.3 mg/L，MIC 為0.4 mg/L。親本敏感菌株GZGY 在含0.4～6 mg/L (質量濃度逐代遞增) 纈菌胺的RSA 平板上繼代培養11 代；親本敏感菌株CFKLQ 在含0.3～1.2 mg/L (質量濃度逐代遞增) 纈菌胺的RSA 平板上繼代培養11 代，逐代測定馴化過的親本菌株對纈菌胺的敏感性，方法見1.2.1 節。根據馴化過的親本菌株在含有大于或等于MIC 纈菌胺的RSA 平板上是否生長，判斷其對纈菌胺是否產生了抗性，并測定馴化獲得的抗性突變體對纈菌胺的抗性水平。

1.2.4 抗性突變體的抗性水平測定 按照DBl3/T 1420—2011《馬鈴薯晚疫病菌抗藥性檢測技術規程》[13]，采用菌絲生長速率法分別測定紫外誘導及藥劑馴化獲得的抗性突變體及其親本菌株對纈菌胺的EC50值，求出各抗性突變體的抗性水平。抗性水平 = 抗藥性突變體EC50值/親本敏感菌株EC50值。

致病疫霉對纈菌胺抗性等級的劃分：敏感(S)，敏感性(EC50值)≤敏感基線的95%置信限上限，抗性水平≤(敏感基線的95% 置信限上限/敏感基線)；低抗(LR)，(敏感基線的95%置信限上限/敏感基線)<抗性水平≤10 倍；中抗(MR)，10 倍<抗性水平≤100 倍；高抗(HR)，抗性水平>100 倍。

1.2.5 抗性突變體對不同藥劑的交互抗性測定 參照羅彥濤等[16]的方法，采用菌絲生長速率法分別測定8 個抗性突變菌株及其6 個親本敏感菌株對烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺、甲霜靈、嘧菌酯、霜脲氰和氟吡菌胺等6 種常用防治晚疫病內吸性殺菌劑的敏感性。用SPSS 軟件進行皮爾遜檢驗，分析抗性突變菌株及其親本敏感菌株對纈菌胺的EC50值的對數值與抗性突變菌株及其親本敏感菌株對其他6 種常用晚疫病防治藥劑中每種藥劑的EC50值對數值之間的相關性，記錄相關系數。如果P> 0.05，即表明在P= 0.05 的水平下差異不顯著，說明兩種藥劑之間無相關性，表明纈菌胺與該藥劑之間不存在交互抗性關系；如果P< 0.05，表明纈菌胺與該藥劑之間有相關性。相關系數越高，相關性越大，通常相關系數大于0.75 時，則認為兩種藥劑之間存在交互抗性關系。

1.3 數據分析

采用DPS 7.05、SPSS 26.0 及Microsoft Excel軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 致病疫霉對纈菌胺敏感基線建立

纈菌胺對從河北、內蒙古、貴州、四川、黑龍江等省或自治區未使用過纈菌胺或鮮用其他羧酸酰胺類殺菌劑的地區采集的105 個菌株的EC50值范圍為0.0594～0.159 mg/L (圖1)，敏感性差異為2.7 倍，平均值為(0.102 ± 0.024) mg/L，通過DPS 軟件進行W 正態檢驗：W= 0.980，P=0.141 (> 0.05)，敏感性頻率分布呈連續單峰曲線，未觀察到對纈菌胺敏感性明顯下降的抗性亞群體，說明所測菌株均為對纈菌胺敏感的野生菌株，以菌株出現頻率為縱坐標、有效抑制中濃度區間為橫坐標，畫出105 個野生敏感菌株對纈菌胺的敏感性分布曲線 (圖2)，同時將105 個野生敏感菌株平均EC50值(0.102 ± 0.024) mg/L 作為致病疫霉對纈菌胺的敏感基線。

圖1 105 株致病疫霉菌株對纈菌胺的敏感性分布Fig. 1 Senisitivity distribution of 105 isolates of Phytophthora infestans to valifenalate

圖2 致病疫霉對纈菌胺的敏感基線Fig. 2 Sensitivity baseline of Phytophthora infestans to valifenalate

2.2 致病疫霉對纈菌胺抗性突變體抗性水平

由表2 可知，紫外照射致病疫霉菌絲體的亞致死時間為30 min，紫外照射孢子囊懸浮液的亞致死時間為120 s。

表2 紫外誘變試驗亞致死時間的確定Table 2 Determination of sublethal time in ultraviolet mutagenesis test

通過紫外線照射敏感菌株的菌絲體，共處理736 個菌塊，獲得了4 個對纈菌胺的抗性突變體，抗性水平為3.2～14.9 倍，突變頻率為0.54%；通過紫外線照射敏感菌株孢子囊懸浮液，共照射用孢子囊懸浮液涂布的RSA 平板300 皿，獲得了2 個對纈菌胺的抗性突變體，抗性水平分別為8.1 倍和8.2 倍，突變頻率為1.33 × 10?7；通過對野生敏感菌株進行藥劑馴化11 代，獲得了2 個抗性水平分別為3.1 倍和9.4 倍的抗性突變體 (表3和表4)。通過紫外誘導和藥劑馴化共獲得8 個對纈菌胺抗性突變體 (表5)。

表3 致病疫霉親本菌株GZGY 經藥劑馴化獲得對纈菌胺抗性過程Table 3 The acquisition of resistance to valifenalate in Phytophthora infestans parent strain GZGY

表4 致病疫霉親本菌株CFKLQ 經藥劑馴化獲得對纈菌胺抗性過程Table 4 The acquisition of resistance to valifenalate in P. infestans parent strain CFKLQ

表5 致病疫霉對纈菌胺抗性突變體的抗性水平Table 5 Resistance factor to valifenalate of the valifenalate-resistant mutants of P. infestans

2.3 纈菌胺與其他藥劑的交互抗藥性

結果表明：致病疫霉對纈菌胺不同抗性突變體及其親本敏感菌株對纈菌胺 EC50對數值(lgEC50)與對雙炔酰菌胺、烯酰嗎啉的 EC50對數值(lgEC50)之間相關系數(r)分別為0.862 和0.890，表明纈菌胺與烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺之間存在交互抗性關系；致病疫霉對纈菌胺的不同抗性突變體及其親本菌株的 lgEC50分別與嘧菌酯、氟吡菌胺、甲霜靈和嘧菌酯lgEC50之間的相關系數分別為0.175、0.281、0.255 和 ?0.108，表明纈菌胺與嘧菌酯、氟吡菌胺、甲霜靈和霜脲氰之間無交互抗性 (圖3)。

圖3 致病疫霉對纈菌胺及其他6 種殺菌劑交互抗性模式Fig. 3 Cross-resistance patterns of P. infestans to valifenalate and the other 6 fungicides

3 結論與討論

羧酸酰胺(CAA)類殺菌劑是一大類作用機理不同于其他防治作物卵菌病害的苯基酰胺類 (甲霜靈、精甲霜靈、霜靈)、QoI 類殺菌劑 (嘧菌酯、吡唑醚菌酯、啶氧菌酯等)、吡啶酰胺類 (氟吡菌胺)、哌啶基噻唑異唑啉類 (氟噻唑吡乙酮)、氰基乙酰類 (霜脲氰) 和咪唑類 (氰霜唑) 殺菌劑的新型高效內吸殺菌劑，包括烯酰嗎啉 (dimenthomorph)、雙炔酰菌胺 (mandipropamid)、纈霉威 (iprovalicarb)、氟嗎啉 (flumorph)、苯噻菌胺 (benthiavalicarb)、異苯噻菌胺 (benthiavalicarb-isopropyl)、纈菌胺(valifenalate) 和丁吡嗎啉 (pyrimorph)。

采用QoI 類殺菌劑嘧菌酯防治黃瓜霜霉病，苯基酰胺類甲霜靈防治馬鈴薯晚疫病及黃瓜霜霉病2～3 年即出現抗藥性問題，這些病原菌對該類藥劑已具有中至高度抗性風險[17-18]，而致病疫霉等卵菌對羧酸酰胺類殺菌劑烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺存在低至中度抗性風險[19-20]，烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺等與QoI 類殺菌劑、苯基酰胺類殺菌劑之間無交互抗性[21-22]，除纈菌胺和丁吡嗎啉外，烯酰嗎啉、氟嗎啉、雙炔酰菌胺和纈霉威單劑或混劑在田間用于防治馬鈴薯晚疫病、黃瓜霜霉病、葡萄霜霉病和辣椒疫病的時間已遠超10 年，盡管有些國家已檢測到田間靶標菌對烯酰嗎啉的抗性菌株，如1994 年法國用烯酰嗎啉防治葡萄霜霉病8 年后發現田間抗性菌株[23]，隨后意大利、瑞士、德國及中國檢測到黃瓜霜霉病菌、辣椒疫霉等卵菌對雙炔酰菌胺和氟嗎啉的田間抗性菌株[24-26]，但目前羧酸酰胺類殺菌劑防治晚疫病等卵菌病害仍然維持良好的防效。

本研究通過紫外誘導和藥劑馴化方法均獲得了致病疫霉對纈菌胺的抗性突變體，但抗性突變體抗性水平較低，同時纈菌胺與有低至中度抗性風險的烯酰嗎啉及雙炔酰菌胺之間有交互抗性關系，與具有高度抗性風險的甲霜靈和嘧菌酯、有中度抗性風險的氟吡菌胺和有低度抗性風險的霜脲氰之間無交互抗性，由此初步推測，纈菌胺與烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺具有相同的作用機理，致病疫霉對纈菌胺有低至中度抗性風險，這一結論尚待研究致病疫霉對纈菌胺抗性突變體的遺傳穩定性、競爭力、適合度及機理等生物學性狀及監測登記產品纈菌胺 ? 代森錳鋅使用地區致病疫霉群體對纈菌胺的敏感性下降趨勢后進一步評估。雖然纈菌胺與烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺之間存在交互抗性，但是纈菌胺仍可與其他保護性殺菌劑或內吸性殺菌劑混用，以防治馬鈴薯和番茄晚疫病等卵菌病害。

致病疫霉被國際殺菌劑抗性行動委員會(FRAC)劃分為具有高度抗性風險的病原菌[27]，因此不能忽視其對羧酸酰胺類殺菌劑的抗性治理。建議在實際應用中，應限制每個生長季節羧酸酰胺類殺菌劑使用不超過3 次，嚴格按照推薦劑量用藥，并與多作用位點的保護性殺菌劑 (代森錳鋅、百菌清等) 或與其無交互抗性的其他作用機理的藥劑(氟吡菌胺、嘧菌酯、氟噻唑吡乙酮、霜脲氰等)混用或交替使用，以延緩病原菌抗性的產生，延長羧酸酰胺類殺菌劑的使用壽命。此外，在推廣使用登記產品纈菌胺 ? 代森錳鋅制劑防治晚疫病后，應密切關注田間纈菌胺防治晚疫病的防治效果，監測不同年份、不同地區致病疫霉對纈菌胺敏感性的變化，并對纈菌胺田間藥效進行驗證，進一步評估田間致病疫霉的抗性風險，為纈菌胺等羧酸酰胺類殺菌劑持久發揮良好的防治效果提供參考。