羌活提取物微乳劑制備及體外抗真菌活性

張智蕊, 趙 晴, 李宗霖, 寇俊杰, 李 嬌, 徐鳳波, 李慶山

(南開大學 化學學院，元素有機化學國家重點實驗室，天津 300071)

當前，對于植物病害的防治主要以施用化學農藥為主。世界衛生組織推測，每年有近 100 萬噸農藥被施用于地球地表[1]。農藥的過度施用導致二氧化碳濃度升高、營養物質污染和耐藥性出現[2-3]。因此，化學成分多樣、低殘留及廣譜高效的新型可持續的植物源殺菌劑[4]受到廣泛關注。如在美國頒布的《食品質量保護法》中要求減少化學農藥的使用量，大力開發植物源產品作為化學農藥的替代品[5]。目前，中國植物源農藥登記產品較少，尋找合適的植物來源對開發植物源殺菌劑具有重要意義。

已有研究表明，一些植物源提取物顯示出較好的抑制病原菌的作用[6-8]。Fielding 等[9]使用非洲加侖、歐洲風鈴草、非洲風信子等8 種植物提取物與醚菌酯聯合防治蘋果灰霉病，均顯示出優異的協同和相加作用。劉景坤等[10]發現，傘形科植物羌活Notopterygium incisumTing ex H. T. Chang地上部分提取物對尖孢鐮刀菌、番茄早疫病菌和灰葡萄孢的生長具有顯著的抑制作用，其中香豆素類化合物是其主要抑菌成分。植物羌活的干燥根莖和根是常用于治療外感風寒、上肢風濕疼痛等的中草藥(Notopterygii Rhizoma et Radix)，其主要成分為香豆素類和有機酸類化合物，具有顯著的抗菌、消炎功效。為探討中草藥羌活在農業領域應用的可行性，本研究對其提取物進行了研究。

羌活提取物為深棕色混合物，水溶性較差，難以直接施用，而微乳劑的開發為其在農業抑菌中的應用提供了基礎。微乳劑是一種透明或半透明且熱力學穩定的液-液分散體系，與乳油相比，其有機溶劑的用量少，粒徑小，具有安全、低毒、易被植物根部吸收等優點，且具有更為優良的外觀和穩定性[11-13]。

鑒于此，筆者圍繞羌活提取物微乳劑的制備工藝、性能及抑菌活性等方面開展研究，同時以制備的羌活提取物乳油為對照。通過測試微乳劑的穩定性、pH 值和降解率等性能指標，對羌活提取物、溶劑和乳化劑的含量等進行篩選，確定制備不同含量的羌活提取物微乳劑的最優配方，采用菌絲生長速率法對比分析其對植物病原菌的抑制活性；通過測定其接觸角、靜態表面張力和動態表面張力等指標表征其應用性能，旨在為羌活等中草藥提取物在農業領域的應用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料與儀器

試劑與藥劑：羌活醇 (notopterol)標準品 (純度99.9%，成都普思生物科技股份有限公司)；乳化劑HMK-2100 (北京漢莫克化學技術有限公司)；消泡劑AF1506 (廣州方中化工有限公司)；溶劑均為市售分析純，未經處理直接使用。97%噻呋酰胺(thiofuramide) 原藥 (湖北速普爾化工有限公司)；97%多菌靈(carbendazim)原藥 (天津希恩思奧普德科技有限公司)。

中草藥：干燥羌活 (Notopterygii Rhizoma et Radix) 飲片 (產地四川，北京同仁堂集團有限公司)。

供試菌株：禾谷絲核菌 (小麥紋枯病菌Rhizoctonia cerealis)、辣椒疫霉Phytophthora capsici、水稻稻瘟病菌Pyricularia grisea和立枯絲核菌 (水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani)，由南開大學農藥國家工程 (天津) 研究中心分離鑒定并保存。

儀器：SENCO-R206D 旋轉蒸發儀 (上海申生科技有限公司)；JK99M 全自動張力儀 (上海中晨數字技術設備有限公司)；BP-100 型動態表面張力儀 (KRüSS)；UPR-11-5T 型超純水器 (四川優普超純科技有限公司)；Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀；ME20A 電子天平 (梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；接觸角測量儀 (KRüSS)；動態干燥度分析儀 (法國Formulaction 儀器公司)；電磁式加熱攪拌器 (Thermo Fisher Scientific (China)Co. Ltd) 。

1.2 試驗方法

1.2.1 羌活中香豆素類活性成分的提取 將干燥羌活飲片粉碎成粒徑約75 μm 的細粉。稱取40 g粉末分散到400 g 70%的乙醇水溶液 (料液質量比1 : 10) 中，攪拌加熱，回流2 h，冷卻，抽濾，得到第1 次提取物溶液；向濾渣中加入400 g 70%的乙醇水溶液，回流提取2 h，冷卻，抽濾，得到第2 次提取物溶液。合并提取液，減壓脫除溶劑，得羌活提取物。

將羌活提取物用50 mL 純水分散，不斷振蕩使其溶解后置于分液漏斗中，分次加入50 mL 乙酸乙酯，振蕩后靜置0.5 h，分出乙酸乙酯萃取液；向水層中加入50 mL 乙酸乙酯，重復上次操作，得到第2 次乙酸乙酯萃取液。合并兩次萃取液，減壓脫除溶劑，得膏狀羌活提取物，收率7.17%。

采用高效液相色譜法 (HPLC) 測定其有效成分含量，采用C18色譜柱 (150 mm) ，流動相為乙腈(A) -水 (B) 梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長315 nm，進樣量20 μL，柱溫30 ℃，色譜條件列于表1。

表1 有效成分羌活醇高效液相色譜分析流動相組成Table 1 Mobile phase ratios in HPLC analysis of active ingredient notopterol

羌活醇對照品溶液配制：準確稱取羌活醇標準品5.3 mg，配制質量濃度分別為0.53、0.26、0.13、0.07 和0.03 mg/mL 的羌活醇甲醇溶液，按照表1 條件進行HPLC 分析。

羌活提取物樣品溶液配制：稱取羌活提取物191.2 mg 于10 mL 容量瓶中，用色譜純甲醇定容，振蕩搖勻，使用微孔有機濾膜(Φ13 mm，0.45 μm)過濾，按照表1 條件進行HPLC 分析。

利用外標法繪制羌活醇工作曲線，并根據工作曲線計算羌活提取物中羌活醇含量。

1.2.2 羌活提取物微乳劑的制備及配方篩選

1.2.2.1 微乳劑的制備 采用轉相乳化法[14]，分別將1.0 g 和3.0 g 羌活提取物加入裝有攪拌裝置的燒瓶中，勻速攪拌下依次加入溶劑、乳化劑、防凍劑和消泡劑，充分混合后成為透亮均勻油相。攪拌下緩慢滴加純水，體系由透亮的油相逐漸變渾濁。繼續加水攪拌，體系逐漸再次變成透亮溶液。加水補足設定質量后，在1500 r/min 下繼續攪拌加熱30 min，冷卻至室溫制得穩定的水包油(O/W)型的5%羌活提取物微乳劑及15%羌活提取物微乳劑。

1.2.2.2 溶劑的篩選 分別以二甲苯、環己酮、異丙醇、乙酸乙酯、甲醇和乙醇為供試溶劑，通過比較羌活提取物的溶解度和冷、熱貯后的外觀變化進行篩選。稱取羌活提取物1 g，用滴管分次加入溶劑，每次0.2 g，記錄羌活提取物完全溶解時溶劑的用量。

1.2.2.3 原藥用量篩選 設置羌活提取物的質量分數分別30%、25%、20%、15%、10%和5%，通過觀察其貯存穩定性及有效成分降解率的平均值篩選其最佳用量。

1.2.2.4 溶劑用量篩選 設置溶劑的質量分數分別為7%、9%、11%、13%、15%和17%，通過評估其穩定性及有效成分降解率進行篩選。

1.2.2.5 乳化劑用量篩選 設置乳化劑HMK-2100的質量分數分別為12%、14%、16%、18%、20%和22%，通過評估其穩定性及有效成分降解率進行篩選。

1.2.3 羌活提取物乳油的制備 將3.0 g 羌活提取物溶解于1.0 g 環己酮中，分別加入1.0 g HMK-2100 乳化劑、0.1 g 嵌段聚醚和4.9 g 乙醇，攪拌混合均勻后得到30%羌活提取物乳油。

1.2.4 微乳劑理化性能試驗 在54 ℃下熱貯14 d后，測定其降解率、乳液穩定性等性能指標[15]。

在0 ℃下保存1 h，觀察有無固體或油狀物析出，繼續在0 ℃下貯存7 d 后，測定其降解率等性能指標[16]。

采用pH 計測定稀釋100 倍后羌活提取物微乳劑的pH 值[17]。

使用標準硬水將試樣稀釋100 倍，在30 ℃ ±2 ℃的恒溫水浴中靜置1 h 后觀察乳液分離情況[18]。

有效成分降解率按照表1 條件采用HPLC 測定。

1.2.5 抑菌活性測試 采用菌絲生長速率法[19]測定。將羌活提取物微乳劑用純水分別稀釋100、300 和500 倍，待測。取滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA) 49 mL 與1 mL 稀釋后的待測微乳劑溶液混合，均分3 份于9 cm 培養皿中。冷卻后，將1 cm供試病原菌菌餅接種于培養皿中央。以49 mL PDA與1 mL 純水的混合物作為空白對照。在28 ℃恒溫箱中黑暗培養7 d 后，用十字交叉法測量菌落直徑，按公式 (1) 計算菌絲生長抑制率。

式中：I為抑制率，%；Dc為對照菌落直徑，cm；Dt為處理菌落直徑，cm。

1.2.6 微乳劑的應用性能測定

1.2.6.1 接觸角的測定 采集新鮮且潔凈的綠蘿葉片，避開葉脈和病斑，剪取平整葉片固定于玻璃板上，輕輕撫平葉片后置于分析儀上。待測液用純水稀釋100 倍，利用微量進樣器吸取稀釋液，每次5 μL 滴加在葉片上。利用影像分析法拍照并測量接觸角，重復測定10 次，取平均值。

1.2.6.2 靜態表面張力的測定 使用鉑金環法[20]，在 (25 ± 1) ℃下，將待測液用純水稀釋100 倍后進行測試，使用0.3 mm 的鉑金環 (外徑20.30 mm，周長61.89 mm，密度0.998 g/mL)，在測定前使用純水對界面張力值進行校準，校準后待鉑金環浸入液面5 mm 以下開始測量，誤差范圍為 ±1 mN/m。重復測定3 次，取平均值。

1.2.6.3 動態表面張力的測定 采用最大氣泡壓力法測定藥液用純水稀釋100 倍后的動態表面張力。測定前使用純水進行校準，其中，毛細管半徑為0.345 mm，溫度25 ℃，測定氣泡表面壽命范圍10～10 000 ms。待測樣品在 (25 ± 1) ℃下進行處理。

2 結果與分析

2.1 羌活提取物中活性成分羌活醇的含量

利用外標法繪制羌活醇工作曲線，以羌活醇峰面積積分值(y)為縱坐標，質量濃度(x)為橫坐標，計算回歸方程為：y= 47058.19835x+ 876.85022，決定系數R2= 0.999。

結果如圖1 所示，羌活醇出現在33.23 min，峰面積21131.4，經計算分析可知，羌活提取物中羌活醇的質量濃度為0.43 mg/mL，對應羌活提取物中羌活醇的質量分數為2.25%。值得注意的是，在保留時間33.80 min 左右出現一個比例較大的組分，經文獻調研確認其為異歐前胡素[21-23]，鑒于在《中國藥典》中對羌活中的異歐前胡素含量未做要求，故本研究中將羌活醇作為羌活標志性成分。

圖1 羌活提取物中羌活醇高效液相色譜分析Fig. 1 HPLC chromatogram of notopterol extracted from Notopterygii Rhizoma et Radix

2.2 溶劑篩選

羌活提取物是一種不溶于水的粘稠浸膏，選擇合適的溶劑是制備微乳劑的重要條件。本研究結果顯示，除用二甲苯溶解后有殘渣外，其余溶劑均能使提取物完全溶解，且甲醇、乙醇、乙酸乙酯的溶解性優于環己酮和異丙醇。然而，單獨使用甲醇、乙醇、乙酸乙酯和異丙醇作為溶劑時，乳化劑的乳化效果較差，導致原藥溶解度下降，溶液易分層。而以環己酮為溶劑時，乳化效果較好。甲醇為中等毒性，其他均為低毒或微毒。綜合考慮乳化效果與溶劑毒性，最終選用環己酮為溶劑、乙醇為助溶劑和防凍劑來制備羌活提取物微乳劑。

2.3 原藥用量篩選

結果 (表2) 表明，當原藥質量分數為15%時，溶液體系的穩定性均符合微乳劑劑型指標，有效成分降解率 (4.34%) 較低，因此在微乳劑制備中選擇原藥質量分數為15%。

表2 羌活提取物原藥含量對微乳劑穩定性影響Table 2 The effects of Notopterygii Rhizoma et Radix extract content on the stability of microemulsion

2.4 溶劑用量篩選

由表3 可知，當溶劑環己酮質量分數為9%時，體系穩定性較好且有效成分降解率符合要求。

表3 溶劑環己酮含量對微乳劑穩定性影響Table 3 The effects of solvent cyclohexanone content on the stability of microemulsion

2.5 乳化劑用量篩選

由表4 數據可以看出，當乳化劑HMK-2100質量分數在16%～20%時乳化效果較好，體系較為穩定，均可得到深褐色透明均一的微乳劑，為降低成本，選擇乳化劑質量分數為16%。

表4 乳化劑HMK-2100 含量對微乳劑穩定性影響Table 4 The effects of emulsifier HMK-2100 content on the stability of microemulsion

2.6 羌活提取物微乳劑最優配方確定及其理化性質

綜合上述篩選條件，確定羌活提取物微乳劑最優配方(質量分數)如下：15%羌活提取物，9%環己酮(溶劑)，16%HMK-2100 (乳化劑)，10%乙醇(助溶劑)，0.1%AF1506 (消泡劑)及49.9%純水。對15%羌活提取物微乳劑及30%羌活提取物乳油按照各自的國家標準進行質量指標測定。結果如表5 所示，制備所得微乳劑和乳油各項指標均符合要求，均具備良好的外觀和質量。

表5 不同劑型配方的理化參數Table 5 Physical and chemical parameters of different formulations

2.7 對植物病原菌的抑制作用

抑菌活性測定結果 (表6) 表明：5%羌活提取物微乳劑、15%羌活提取物微乳劑及30%羌活提取物乳油對供試植物病原菌均具有明顯的抑制作用，且抑菌率隨藥劑質量濃度的增加而增大。在500 mg/L (羌活醇質量濃度為11.25 mg/L) 時，針對辣椒疫霉、水稻稻瘟和水稻紋枯病原菌，15%微乳劑的抑菌效果均優于5%微乳劑。對比15%羌活提取物微乳劑及30%羌活提取物乳油，盡管在有效成分質量濃度相同時兩者的抑菌效果相差不大，但微乳劑中有機溶劑的使用量大幅減少，且微乳劑粒徑在納米級別[24]，藥物在傳遞過程中利用率更高。

表6 不同羌活提取物劑型對植物病原真菌的抑制效果Table 6 The inhibitory effects of different formulations of Notopterygii Rhizoma et Radix extract on plant pathogenic fungi

由表6 可知，15%羌活提取物微乳劑在3 種不同的施藥濃度下對4 種植物病原菌均具有較好的抑制作用，其中在300 mg/L (羌活醇質量濃度為6.75 mg/L) 時，對水稻紋枯病菌和水稻稻瘟病菌的抑制率接近或達到100%。盡管在同等施藥劑量下，羌活提取物微乳劑的抑菌效果與化學類殺菌劑噻呋酰胺及多菌靈還存在一定的差距，但因前者具有較高的生物安全性而具備較大的發展潛力。

2.8 羌活提取物微乳劑的應用性能測試結果

2.8.1 接觸角 有研究表明，雨水可以在辣椒葉片表面形成弧形或半圓形水滴而潤濕植物，但不能潤濕疏水型植物水稻和小麥。綠蘿葉片因具有褶皺的表面可作為疏水型植物的典型代表[25]，因而在新鮮潔凈的綠蘿葉片表面進行藥液應用性能測試具有一定代表性。測試結果(圖2)表明，室溫下15%羌活提取物微乳劑100 倍稀釋液在綠蘿葉片表面的接觸角為52.6° ，根據表面化學的一般原理[26-27]，當θ< 60° 時，表示藥液的親水性強，液滴在植物表面應具有較好的鋪展性和潤濕性。

圖2 15%羌活提取物微乳劑100 倍稀釋液在綠蘿同一葉片不同位置處的接觸角Fig. 2 Contact angle of Notopterygii Rhizoma et Radix extract 15% ME 100-time dilution at different positions on the same leaf of green dill

2.8.2 靜態表面張力測試 經測試，15% 羌活提取物微乳劑稀釋100 倍后藥液的表面張力約為32.95 mN/m，查閱文獻可知，新鮮水稻葉片和小麥葉片的臨界表面張力分別為36.70 和36.90 mN/m，辣椒葉片臨界表面張力值在43.38～45.27 mN/m 之間[28]，15%羌活提取物微乳劑稀釋液的表面張力與小麥、水稻、辣椒葉片的臨界表面張力值相近，因此推測15%羌活提取物微乳劑在使用過程中，在小麥、水稻及辣椒葉片表面應具有良好的潤濕鋪展效果。

2.8.3 動態表面張力測試 由圖3 可知，15%羌活提取物微乳劑經純水稀釋100 倍后，表面張力隨表面年齡增加而顯著減小，在8000 ms 內表面張力降低了約25.57 mN/m。由于動態表面張力是時間的函數，其大小由溶液中的表面活性劑傳遞到新鮮表面的速率和表面吸附量大小決定[29]。一般來說，稀釋后藥液的表面張力越小，液滴越易附著在葉片表面，進而可顯著提高藥液沉積量。由此推測所制備的微乳劑可以在植物葉片表面進行良好的潤濕鋪展。

圖3 15%羌活提取物微乳劑100 倍稀釋液的動態表面張力Fig. 3 The dynamic surface tension of 100 times diluted solution of Notopterygii Rhizoma et Radix extract 15% ME

3 結論

利用羌活提取物分別制備了15%羌活提取物(羌活醇0.34%) 微乳劑、5%羌活提取物 (羌活醇0.11%) 微乳劑和30%羌活提取物 (羌活醇0.68%)乳油，并對15%羌活提取物微乳劑的配方進行了篩選。比較分析了3 種制劑對4 種植物病原菌的抑制效果。結果顯示：在有效成分質量濃度相同時，與5%羌活提取物微乳劑相比，15%羌活提取物微乳劑的抑菌效果更好，且具有更為優異的應用性能；與30%羌活提取物乳油相比，15%羌活提取物微乳劑在相同質量濃度下的抑菌效果相當，但微乳劑中有機溶劑用量大幅減少，成本顯著降低。15%羌活提取物微乳劑的理化性質等指標均符合國家標準；稀釋100 倍溶液在綠蘿葉片接觸角小于60°，靜態表面張力為32.95 mN/m，動態表面張力在一定時間內可快速下降，故稀釋液在葉片表面具有較好的鋪展性和潤濕性；稀釋500 倍 (羌活提取物質量濃度為300 mg/L，羌活醇質量濃度為6.75 mg/L) 后，對水稻稻瘟和水稻紋枯病菌抑制率仍保持在90%以上，對水稻稻瘟和水稻紋枯病菌具有較強抑制作用。