蟲螨腈及其代謝物溴代吡咯腈在芥菜上的殘留行為與膳食風險評估

孫瑞卿, 王 霞, 任鵬程, 金 靜, 李晉棟, 喬雄梧, 秦 曙

(山西農業大學 山西功能農產品檢驗檢測中心，農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室 (太原)，太原 030031)

蟲螨腈 (chlorfenapyr) 作為一種吡咯類化合物，主要作用部位是昆蟲體內細胞線粒體，通過抑制二磷酸腺苷(ADP)向三磷酸腺苷(ATP)的轉化，從而影響昆蟲生命機能所必需能量的形成。該藥通過胃毒及觸殺作用殺死害蟲，且有一定的內吸性，對芥菜夜蛾、小菜蛾、斜紋夜蛾、菜螟、薊馬及菜蚜等多種常見害蟲均有良好的防治效果，持效期長且使用安全[1?2]，已獲準在我國韭菜、茄子、黃瓜、節瓜、豇豆、豆角、姜、柑橘、蘋果、梨、茶以及部分十字花科蔬菜上登記使用[3]，但尚未見其在芥菜上的登記。

農藥殘留聯席會議 (JMPR) 2018 年的評估報告中重新對蟲螨腈及其代謝物的毒性進行了評估[4]，認為雖然代謝物溴代吡咯腈占殘留物總量的比重較低，但其生物毒性卻為蟲螨腈的10 倍，因此溴代吡咯腈的膳食風險也不容忽視，故確定蟲螨腈的監測定義為蟲螨腈，而其風險評估定義為蟲螨腈與代謝物溴代吡咯腈的10 倍之和。

目前已有關于蟲螨腈在茶葉、姜、大白菜、黃瓜、青菜、獼猴桃等作物上殘留行為及風險評估方面的研究報道[5-10]，但同時涉及蟲螨腈及其代謝物溴代吡咯腈的研究卻較少，僅見孫豐收等[11]建立了同時檢測甘藍中蟲螨腈及代謝物溴代吡咯腈殘留的分析方法，馮義志等[12]研究了蟲螨腈及溴代吡咯腈在菜苔中的消解行為及長期膳食攝入風險，尚未見針對蟲螨腈及代謝物溴代吡咯腈在芥菜中殘留行為的研究報道，也未見將溴代吡咯腈列入蟲螨腈殘留物定義進行短期膳食攝入風險評估的研究報道。

本研究遵循《農作物中農藥殘留試驗準則》[13]要求，在我國選擇6 個典型的芥菜種植區開展了規范殘留試驗，分別對蟲螨腈及其代謝物溴代吡咯腈在芥菜葉及根中的殘留行為進行了研究，同時結合我國人群的膳食消費數據，進行了長期及短期膳食攝入風險評估，旨在評估通過食用芥菜攝入的蟲螨腈及溴代吡咯腈殘留對我國居民健康的潛在風險，以期為科學合理制定我國關于蟲螨腈在芥菜上的殘留限量 (MRL) 標準提供依據，同時為該農藥在芥菜上的安全合理使用提供建議。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥劑及試劑

7890B-7010B 三重四級桿氣相色譜-串聯質譜儀(GC-MS/MS，美國 Agilent 公司)；UPLC IClass XEVO TQ-S Micro 超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀 (UPLC-MS/MS，美國 Waters 公司)；GM300 刀式研磨儀 (德國 Retsch 公司)；BS210S 萬分之一電子天平和TP6101 十分之一電子天平 (賽多利斯科學儀器北京有限公司)；5424R型離心機 (德國 Eppendorf 公司)；Talboys 945066型多管渦旋混合儀 (美國 Troemner 公司)。

蟲螨腈 (chlorfenapyr) 標準品 (96.9%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司)；溴代吡咯腈(tralopyril) 標準品 (99.3%，北京曼哈格生物科技有限公司)；100 g/L 蟲螨腈懸浮劑 (SC) ，江蘇龍燈化學有限公司；N-丙基乙二胺 (PSA) 和石墨化碳黑(GCB) (博納艾杰爾科技有限公司)。乙腈、甲醇及甲酸為色譜純，氯化鈉和無水硫酸鎂為分析純。

1.2 田間試驗

根據產品登記廠家推薦，100 g/L 蟲螨腈懸浮劑 (SC) 用于防治十字花科蔬菜上甜菜夜蛾和小菜蛾的使用劑量為有效成分75～105 g/hm2，施藥時期為害蟲為害的防治適期，每季可使用2 次，間隔期5～7 d，整株噴施，建議安全間隔期為14 d。

于2019 年9 月至2020 年4 月，分別在山西、北京、吉林、河南、安徽和貴州6 地開展了100 g/L蟲螨腈懸浮劑在芥菜上的規范殘留試驗。

最終殘留試驗：小區面積均為15 m2，設3 次重復，于芥菜收獲前31 d 左右施藥，施藥劑量為推薦最高劑量 (有效成分105 g/hm2)，施藥2 次。同時增設對比試驗：有效成分105 g/hm2施藥3 次；有效成分157.5 g/hm2(1.5 倍最高推薦劑量)施藥2 次和3 次。施藥間隔期均為5 d。于末次施藥后0、10、14、21 d 隨機采集至少12 株芥菜葉(≥ 1 kg) 及芥菜根 (≥ 2 kg) 樣品。

消解動態試驗：地點為北京和山西兩地，小區面積均為50 m2，不設重復，于芥菜生長到成熟個體一半大小時施藥 (出苗后約30 d)，施藥劑量為1.5 倍最高推薦劑量(有效成分157.5 g/hm2)，施藥1 次。于施藥后2 h 和1、3、5、7、10、14、21、30、45 d 分別采集芥菜葉樣品。所有樣品均切成1 cm 以下碎塊，充分混勻，四分法分取150 g，?20 ℃保存，待測。

1.3 分析方法

1.3.1 儀器檢測條件

1.3.1.1 針對蟲螨腈的GC-MS/MS 檢測

色譜條件：Agilent 19091S-433UI HP-5MS 色譜柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)；進樣口溫度280 ℃，柱溫60 ℃持續1 min，以40 ℃/min 升至170 ℃，再以30 ℃/min 升至280 ℃，保持3 min；載氣為氦氣，流速1 mL/min；進樣量1 μL，不分流進樣。

質譜條件：EI 離子源，電子轟擊源70 eV，離子源溫度2 3 0 ℃；G C-M S/M S 接口溫度280 ℃；溶劑延遲8 min；碰撞氣為氮氣。其余質譜參數見表1。

1.3.1.2 針對溴代吡咯腈的UPLC-MS/MS 檢測

色譜條件：Waters ACQUITY UPLCR BEH C18色譜柱 (50 m × 2.1 mm，1.7 μm)；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL；柱溫35 ℃。流動相A 相為體積分數0.1% 的甲酸水溶液，B 相為純甲醇，梯度洗脫程序：0～2.4 min，A 為90%，B 為10%；2.5～3.5 min，A 為2%，B 為98%；3.6～5 min，A 為90%，B 為10%。

質譜條件：電噴霧離子源 (ESI)；正離子掃描；多重反應監測 (MRM) 模式；毛細管電壓3500 V；離子源溫度400 ℃，脫溶劑氣流量800 L/h；碰撞氣為氬氣，純度>99.999%；其余質譜參數見表1。

表1 蟲螨腈和溴代吡咯腈質譜參數Table 1 MS parameters of chlorfenapyr and tralopyril

1.3.2 樣品前處理

提取：稱取芥菜葉/根樣品5.0 g 于50 mL 離心管中，依次加入乙腈10 mL、氯化鈉 5 g，2500 r/min 渦旋振蕩提取5 min，8000 r/min 離心5 min，待凈化。

凈化：取上清液1.5 mL 至裝有142.5 mg 無水MgSO4、20 mg PSA 和7.5 mg GCB 的2 mL 凈化管中，于2500 r/min 渦旋振蕩3 min，6000 r/min離心2 min，過有機濾膜后移取1 mL 上清液，待GC-MS/MS 檢測。另取0.5 mL 上清液，加入0.5 mL純凈水，混勻，待UPLC-MS/MS 檢測。

1.4 標準溶液配制及標準曲線繪制

用乙腈分別配制1000 μg/mL 的蟲螨腈和溴代吡咯腈標準品母液，并用乙腈逐級稀釋成100、10 和1 μg/mL 的標準儲備溶液；再分別用空白芥菜根、芥菜葉基質溶液稀釋標準儲備溶液，將蟲螨腈配制成0.005、0.02、0.05、0.1、0.2 和0.5 μg/mL 的基質匹配標準工作溶液，進樣量1 μL；將溴代吡咯腈配制成0.0025、0.01、0.025、0.05、0.1 和0.3 μg/mL 的基質匹配標準工作溶液，進樣量5 μL。以基質匹配標準工作溶液質量濃度為橫坐標、對應峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.5 添加回收試驗

分別在空白樣品中添加3 個水平的蟲螨腈和溴代吡咯腈標準溶液，每個水平重復5 次。蟲螨腈添加水平：芥菜根為0.01、0.1 和1 mg/kg，芥菜葉為0.01、0.1 和30 mg/kg；溴代吡咯腈添加水平：芥菜根為0.01、0.05 和0.1 mg/kg，芥菜葉為0.01、0.1 和0.3 mg/kg。按1.3 節所述方法進行樣品提取凈化及分析測定，計算蟲螨腈和溴代吡咯腈的添加回收率及相對標準偏差 (RSD)。

1.6 殘留量的計算和表達

根據JMPR 關于蟲螨腈在植物中代謝的研究結果，其代謝物溴代吡咯腈的量很低，往往低于分析方法的定量限(LOQ)，因此，在計算其用于暴露評估的殘留量時，可作如下處理[4]：1) 如果母體化合物與代謝產物的檢測結果均 < LOQ，則以母體化合物的LOQ 值進行評估；2) 如果母體化合物 ≥ LOQ，而代謝產物 < LOQ，則以母體化合物的殘留值進行評估；3) 如果母體化合物和代謝產物的檢測值均 ≥ LOQ，則以母體化合物加10 倍的代謝產物殘留值進行評估。

1.7 長期膳食攝入風險評估

采用國家農藥殘留標準審評委員會推薦的方法進行膳食攝入風險評估。長期膳食攝入風險計算公式見式(1)和式(2)[14]。

式中：NEDI 指國家估計每日攝入量，mg/kg bw；STMRi為規范殘留試驗農產品中的農藥殘留中值，mg/kg；Fi為該可食用農產品的消費量，kg/d。

長期膳食攝入風險用長期暴露風險商 (RQc)表示。

式中：ADI 為每日允許攝入量，mg/kg bw。當RQc≤ 1 時，認為其長期膳食攝入風險可接受；當RQc> 1 時，則表示長期膳食攝入風險不可接受。

鑒于目前僅有蟲螨腈和溴代吡咯腈在芥菜一種食用農產品上的殘留試驗數據，并無在其他登記作物上的STMR 值，因此不能計算其包含所有登記作物在內的膳食暴露NEDI 值，故只計算芥菜中蟲螨腈和溴代吡咯腈殘留膳食暴露占NEDI的份額以及對RQc的貢獻率 (RQc%)。

1.8 短期膳食攝入風險評估

短期膳食攝入風險采用JMPR 推薦的方法，按式(3)和式(4)進行計算[15]。

式中：NESTI 為短期膳食攝入量，mg/kg bw；Ue為單個芥菜的質量，kg；HR 為最高殘留量，mg/kg；v為變異因子；LP 為大份額膳食消費量，kg；bw 為消費人群平均體重，kg；ARfD 為短期參考劑量，mg/kg bw。

短期膳食攝入風險以%ARfD 表示。

當%ARfD ≤100%時，認為其短期膳食攝入風險處于可接受水平；當%ARfD > 100%時，則其短期膳食風險不可接受。

2 結果與討論

2.1 方法有效性評價

蟲螨腈及其代謝物溴代吡咯腈在芥菜中的添加回收率和RSD 結果見表2。蟲螨腈在0.005～0.5 mg/kg、溴代吡咯腈在0.0025～0.3 mg/kg 范圍內，峰面積與質量濃度間呈良好的線性關系，R2>0.99。二者在芥菜葉及芥菜根中的定量限 (LOQ)均為0.01 mg/kg。平均回收率在89%～105%之間，RSD 在1%～4%之間。上述結果均在《農作物中農藥殘留試驗準則》允許的范圍內[13]。

表2 蟲螨腈和溴代吡咯腈在芥菜中的添加回收率和相對標準偏差Table 2 The recoveries and RSD of chlorfenapyr and tralopyril in mustard

2.2 最終殘留結果

100 g/L 蟲螨腈懸浮劑以有效成分低劑量(推薦劑量，105 g/hm2)和高劑量(1.5 倍推薦劑量，157.5 g/hm2) 施藥2～3 次，6 地的最終殘留試驗結果 (表3) 顯示：芥菜根中蟲螨腈的原始沉積量為0.032～0.86 mg/kg，溴代吡咯腈為未檢出；芥菜葉中蟲螨腈和溴代吡咯腈的原始沉積量分別為1.15～29.56 mg/kg 和 < 0.010～0.38 mg/kg。芥菜根及芥菜葉中蟲螨腈母體、代謝物溴代吡咯腈殘留量及蟲螨腈殘留物總量基本上均隨著采收間隔期的延長而降低，在芥菜葉中表現尤為明顯：14 d時芥菜葉中蟲螨腈殘留量最高值為22.59 mg/kg，21 d 時降至4.59 mg/kg，下降了約80%。蟲螨腈母體及其代謝物在芥菜葉中的最終殘留量遠高于其在 根中的殘留量，其原因可能是因為施藥方式為葉面噴施，導致芥菜葉中原始沉積量較高。代謝物溴代吡咯腈在芥菜根及芥菜葉中的殘留量占蟲螨腈殘留物總量的比重均較低。目前，我國、國際食品法典委員會(CAC)、歐盟、美國及日本均未制定蟲螨腈在芥菜中的最大殘留限量 (MRL) 。

2.3 消解動態

蟲螨腈母體在芥菜葉中的消解動態符合一級反應動力學方程，消解曲線見圖1，消解動態參數見表4。蟲螨腈母體在北京試驗點芥菜葉中的消解快于山西試驗點，這可能是由于試驗期間北京平均氣溫(13.7 ℃) 高于山西(10.4 ℃)，且總降水量(84.4 mm)也遠多于山西(0.8 mm)所致，表明蟲螨腈在芥菜葉上的消解與試驗期間氣溫及降水量關系密切。代謝物溴代吡咯腈在芥菜葉中的消解趨勢同母體蟲螨腈，殘留量隨采收時間的延長基本呈遞減趨勢，在山西和北京兩地分別于10 d 和14 d 時其消解率已達99.9%以上，但因擬合曲線符合性太差未進行一級反應動力學方程擬合。

表4 蟲螨腈母體在芥菜葉中的消解參數Table 4 Dissipation parameters for chlorfenapyr in the mustard leaf

圖1 蟲螨腈母體在山西 (A) 和北京 (B) 兩地芥菜葉中的消解曲線Fig. 1 Digestion curves of chlorfenapyr in mustard leaf in Shanxi (A) and Beijing (B)

2.4 長期膳食攝入風險

蟲螨腈的ADI 值為0～0.03 mg/kg bw[16]。當以推薦使用最高劑量 (有效成分105 g/hm2) 施藥2 次前提下，距末次施藥后14 d，芥菜根和葉中蟲螨腈的最終殘留中值STMRi(蟲螨腈 + 溴代吡咯腈 ×10) 分別為0.056 mg/kg 和1.02 mg/kg。以我國3～5 歲兒童平均體重為17.63 kg[17]、一般人群平均體重為53.23 kg[18]計，結合WHO 用于長期膳食暴露評估推薦的數據源[19]中各年齡段居民不同百分位點的膳食消費量/體重調查數據，計算得到在不同百分位點膳食消費量情況下,芥菜葉中蟲螨腈殘留對一般人群及3～5 歲兒童長期暴露風險商(RQc)的貢獻率，以RQc% 表示 (表5)。由于相關平臺中并無與芥菜根相對應的膳食消費數據，因此無法計算芥菜根中蟲螨腈殘留量對長期膳食攝入風險的貢獻率，但鑒于蟲螨腈在芥菜根中的殘留量相對于芥菜葉很低 (表3)，因此認為芥菜根中蟲螨腈殘留量對長期膳食風險的貢獻率很低，可忽略不計。

表3 芥菜中蟲螨腈、溴代吡咯腈及蟲螨腈總量(評估定義)的最終殘留Table 3 Final residues of chlorfenapyr, tralopyril and total chlorfenapyr (evaluation definition) in mustard

由表5 中數據可看出：對于一般人群和3～5 歲兒童群體，芥菜葉中蟲螨腈殘留量對風險商的貢獻率普遍較低，僅為0.12%～2.47%，且同一消費群體隨著消費人群百分位點的增大，RQc%值亦增大。一般人群通過攝入芥菜葉中蟲螨腈殘留，在50%、95%和97.5% 位點處的RQc% 值分別為0.12%、0.40%和0.49%；3～5 歲兒童通過攝入芥菜葉中蟲螨腈殘留，在50%、95%和97.5%位點處的RQc%值均高于一般人群，分別為0.64%、2.03%和2.47%。綜合考慮后認為，運用97.5% 位點處的膳食統計數據更符合風險評估要求，且因為兒童的膳食攝入特點有別于一般人群或成年人，因此根據國際膳食暴露評估 (如WHO 推薦的JMPR 農藥殘留膳食暴露評估) 慣例，可用3～5 歲年齡組的評估結果代表對兒童消費群體的膳食風險。

表5 芥菜葉中蟲螨腈殘留的長期膳食攝入風險評估結果[19]Table 5 The results of long-term dietary intake risk assessment of chlorfenapyr in mustard leaf[19]

2.5 短期膳食攝入風險

蟲螨腈的ARfD 值為0.03 mg/kg bw[19]。根據WHO GEMS/FOOD (全球環境監測系統/食品污染監測與評估規劃) 2017 年公布的數據[18]，我國1～6歲兒童的芥菜葉大份額膳食消費量 (LP) 為299.31 g，一般人群的LP 為554.45 g，單個芥菜的質量(Ue)為245 g，變異因子(v)選定為3，我國1～6 歲兒童的平均體重為16.14 kg，一般人群平均體重為53.23 kg，則芥菜葉中蟲螨腈 (總量) 在4 種不同情景下的最終殘留試驗最高值 (HR，蟲螨腈 + 溴代吡咯腈 × 10) 見表6。根據公式 (3) 和公式 (4) 計算得芥菜葉中蟲螨腈殘留對我國1～6 歲兒童及一般人群的短期膳食暴露風險。由于IESTI 估算表中并無與芥菜根相對應的膳食消費數據，因此無法進行蟲螨腈在芥菜根中殘留的短期膳食風險評估。

參考膳食攝入風險評估的基本原則，%ARfD越大意味著該農藥的攝入風險越大。由表6 可看出，在情景1 (推薦使用最高劑量) 前提下，芥菜葉中蟲螨腈殘留對我國1～6 歲兒童及一般人群的%ARfD 值分別為1299%和521%。增加施藥劑量和施藥次數將直接導致HR 值增大，從而使蟲螨腈對我國1～6 歲兒童及一般人群的%ARfD值增大，例如情景2 前提下的%ARfD 值分別為1715%和688%，情景3 前提下的%ARfD 值分別為1725%和692%。情景4 (推遲采收間隔期至21 d)，與情景1 的%ARfD 值相比，隨著HR 值的減小，芥菜葉中蟲螨腈殘留對我國1～6 歲兒童及一般人群的%ARfD 值均有所降低。

表6 蟲螨腈的短期膳食攝入風險評估結果Table 6 The results of short-term dietary intake risk assessment of chlorfenapyr

4 種情景下，芥菜葉中蟲螨腈殘留對我國1～6 歲兒童及一般人群均存在較高的短期膳食攝入風險，且對1～6 歲兒童的風險遠高于對一般人群的風險，%ARfD 值約為普通人群的3 倍。本團隊前期研究顯示，規范殘留試驗前提下，白菜中的蟲螨腈殘留對我國1～6 歲兒童及一般人群同樣也存在明顯的短期膳食攝入風險，%ARfD 值分別為940%和520%[20]。

3 結論

1) 本研究建立了快速、簡便的檢測芥菜葉和根中蟲螨腈及代謝物溴代吡咯腈殘留的分析方法。樣品經乙腈提取，分散固相萃取凈化后，采用GC-MS/MS 檢測蟲螨腈、UPLC-MS/MS 檢測溴代吡咯腈，并運用該方法進行了試驗樣品的殘留量測定。

2) 最終殘留和消解動態試驗結果表明：蟲螨腈母體及其代謝物溴代吡咯腈在芥菜葉中的最終殘留量均遠高于其在根中的殘留量，這可能與施藥方式為葉面噴施有關，且殘留量基本隨采收時間的延長呈遞減趨勢；蟲螨腈在芥菜葉中的消解半衰期為4.2～5.9 d，屬易降解農藥；溴代吡咯腈在芥菜葉中的消解動態擬合曲線符合性差，未能計算其半衰期，在山西和北京兩地分別于10 d和14 d 時其消解率已達99.9%以上。

3) 100 g/L 蟲螨腈懸浮劑以推薦使用最高劑量(有效成分105 g/hm2) 施藥2 次，施藥間隔期為5 d，采收間隔期為14 d，長期及短期膳食攝入風險評估結果表明：芥菜葉中蟲螨腈殘留對我國一般人群和3～5 歲兒童的長期膳食暴露風險商的貢獻率均較低，對我國1～6 歲兒童及一般人群均存在不可接受的短期膳食攝入風險，但加工后芥菜葉中蟲螨腈的降解規律還有待進一步研究，以最終明確其短期膳食攝入風險是否可接受。

4) 本研究采用推薦使用最高劑量(105 g/hm2)、施藥2 次、間隔5 d、安全采收間隔期14 d 的殘留量數據進行長期及短期膳食攝入風險評估，認為是遵從了良好農業規范前提下的最糟(worst case)方式，適用于制定農藥MRL 標準時進行的長期及短期膳食風險評估。若選擇157.5 g/hm2或施藥3 次情況下的殘留數據進行評估，將使最終殘留試驗的HR 值和STMR 值增大，直接導致推薦的MRL值偏高，有可能在一定程度上降低MRL 標準對居民安全膳食的保護水平。

5) 目前我國在制定農藥MRL 標準時，盡管采用了規范殘留試驗數據，但是并未將短期膳食攝入風險評估納入考量范圍，而從本研究的評估結果可以看出，即使殘留量未超標也仍可能存在不可接受的短期膳食攝入風險。因此建議我國在進行農藥登記及制訂、修訂食品中農藥MRL 標準時，不僅要進行長期膳食攝入風險評估，針對一些有短期膳食攝入考量 (即已制定ARfD 值) 的農藥，還應同時考慮其短期膳食攝入風險[21]。

6) 隨著采收時間的延長，芥菜葉中殘留蟲螨腈的短期膳食攝入風險有所降低，因此，對于短期膳食攝入風險較高的農藥，應適當延長其安全采收間隔期，以降低農藥殘留量，保證對各類人群的短期膳食攝入風險均在可接受范圍內。同時1～6 歲兒童因平均體重較輕，造成其短期膳食攝入風險遠高于一般人群，因此在制定MRL 標準時應充分考慮對此類人群的保護水平。

7) 本研究參照JMPR 制定的ARfD 值進行短期膳食暴露評估，膳食消費數據來自WHO GEMS/FOOD 中關于我國人群的消費數據。評估人群通常分為3 大類：1～6 歲兒童、一般人群和育齡婦女，其中1～6 歲兒童的膳食結構實際存在很大差異，將1～6 歲兒童的暴露參數統一劃為一個水平，容易過高估計對1～2 歲低齡兒童的短期膳食攝入風險。因此，建議相關部門應盡快建立并完善我國的短期膳食暴露評估方法體系及針對不同人群、不同食物的短期膳食消費量數據庫，并充分考慮低齡幼兒的膳食特殊性，將膳食消費數據細化至兒童生長期的不同階段，從而為保障我國居民的膳食安全提供更加詳盡的基礎數據。