超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法快速篩查香櫞中180 種農藥殘留
2022-06-14 09:31:06劉光瑞朱仁愿王行智戚鵬飛
農藥學學報 2022年3期
陳 婷, 張 文, 劉光瑞, 朱仁愿, 閆 君,王行智, 戚鵬飛, 陳 敏
(蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院，甘肅省種植中藥材外源性污染物監測工程研究中心，蘭州 730050)
香櫞 Fructus Citri 為蕓香科植物枸櫞Citrus medicaL. 或香圓Citrus wilsoniiTanaka 干燥成熟的果實，具有理氣保肝、和胃活血、化痰止咳、溫脾止瀉等功效，被國家衛健委列為藥食同源中藥材[1]。香櫞在種植過程中不可避免地會發生病蟲草害，需要使用農藥進行防治[2]。近年來，中藥材殘留農藥超標的報道時有發生，國外對產自中國的菊花、枸杞、金銀花等常用中藥材進行抽樣檢測，發現90%的樣品中被檢測出農藥殘留[3-4]，因此，建立香櫞中農藥多殘留快速篩查方法對提升香櫞質量安全檢測水平十分必要。
在《中國藥典》(2020 版) 中，農藥的檢測方法主要有液相色譜-串聯質譜法和氣相色譜-串聯質譜法[5]。這些方法的靈敏度高，靶向性強，但分辨力低，只適合已知目標化合物的檢測，對大范圍非靶向化合物的篩查能力有限。Q-TOF 技術基于精確質量數、同位素分布和源內碎裂離子等條件對目標化合物進行定性測定，具有高通量、非靶向的優點，在無標準品的前提下，可快速、準確、高效地同時篩查復雜樣品中大量目標化合物[6-11]。目前針對香櫞中的農藥殘留檢測尚未見報道。本文通過對比藥典方法中固相萃取法和QuEChERS 法兩種前處理方法，優化提取凈化步驟，結合Q-TOF 快速篩查技術，建立了中藥材香櫞中180 種農藥殘留的高通量非靶向快速篩查方法，旨在為香櫞中農藥殘留風險監測提供技術保障。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
Agilent 1290 超高效液相色譜/6540 四極桿-飛行時間質譜儀(美國安捷倫公司) ，配有雙電噴霧離子源(dual Jet Stream ESI)； KS501 搖床和RV10旋轉蒸發儀 (德國IKA 公司)；Centrifuge 5810R高速離心機 (德國Eppendorf 公司)；VORTEX-5渦旋混勻器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；EVA50A 氮吹儀 (中國北京普立泰科儀器有限公司)；Milli-Q 超純水機 (美國Millipore 公司)；ME204/02 電子天平 (美國梅特勒公司) 。
180 種農藥標準品 (純度≥95 %，德國Dr Ehrenstorfer 公司)；乙腈、甲醇、甲苯、甲酸和乙酸銨 (色譜純，德國Merck 公司)；無水硫酸鎂、無水乙酸鈉、N-丙基乙二胺 (PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠 (C18)、硅膠、石墨化碳黑 (GCB) (分析純，中國天津博納艾杰爾科技有限公司)；試驗用水為Milli-Q 超純水。
1.2 樣品前處理
香櫞采集自藥材市場，粉碎后過50 目篩(355 ±13 μm)。準確稱取3 g 樣品 (精確至0.01 g) 于50 mL離心管中，加入15 mL 超純水，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min；加入15 mL 酸化乙腈 (含體積分數為1 %乙酸的乙腈溶液) ，渦旋混勻，置振蕩器上劇烈振蕩5 min；加入無水硫酸鎂和無水乙酸鈉混合粉末7.5 g，立即搖散，再置振蕩器上劇烈振蕩5 min，于4000 r/min 下離心5 min；取9 mL上清液，置于預先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管 (無水硫酸鎂900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、硅膠300 mg 和GCB 90 mg) 中，渦旋混勻，置振蕩器上劇烈振蕩5 min，于4000 r/min 下離心5 min；取5 mL 上清液，置氮吹儀上于40 ℃水浴濃縮至近干，用V(乙腈) :V(水) = 3 : 2 溶液稀釋并定容至1.0 mL，渦旋混勻，過0.22 μm 微孔濾膜，制得空白基質溶液，待測定。
1.3 檢測條件
色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(2.1 mm × 100 mm，3.5 μm)；流動相A 相為0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨水溶液，B 相為乙腈-0.1%甲酸溶液。梯度洗脫程序：0 min，90% A；1 min，70%A；>1～15 min，40%A；>15～23 min，10%A；23.01 min ，90%A， 保持4 min。流速0.4 mL/min；柱溫 40 ℃；進樣量2 μL。
質譜條件：電噴霧電離源正離子模式(ESI+)；干燥氣溫度325 ℃；干燥氣流速10 L/min；霧化器壓力3.1 × 105Pa；毛細管電壓4000 V；噴嘴電壓500 V；鞘氣溫度325 ℃；鞘氣流速11 L/min；全掃描(TOF-Scan) 模式；全掃描范圍：m/z50～1000；目標化合物二級碎片離子掃描模式(Targeted MS/MS)m/z50～1000，在Spectral Parameters 項下Targeted List 中設置目標母離子MS/MS 碰撞能量分別為5、15、25、35 和45 V，180 種農藥及其質譜信息見表1。
表1 180 種農藥的保留時間、基質效應及質譜信息Table 1 Retention times，matrix effects and mass parameters of 180 pesticides
續表1Table 1 (Continued)
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1.4 標準溶液的配制及標準曲線的繪制
1.4.1 標準儲備液的配制 稱取180 種農藥標準品各25 mg，分別置于25 mL 容量瓶中，根據標準品的性質選擇丙酮、甲醇等溶劑溶解并定容至刻度，配制成質量濃度為1000 mg/L 的單一農藥標準儲備液，于 ?18℃避光保存。
1.4.2 混合標準液的配制 準確移取一定體積的單一農藥標準儲備液于25 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，配制成質量濃度為1 mg/L 的混合標準液，于4 ℃避光保存。
1.4.3 基質匹配混合標準工作液配制 量取農藥混合標準液，用空白基質溶液稀釋，配制成質量濃度分別為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05 和0.1 mg/L 的系列基質匹配混合農藥標準工作液，于4 ℃避光保存。
取基質匹配混合農藥標準工作液按1.3 節的條件測定，以化合物濃度(x) 為橫坐標，離子對峰面積(y) 為縱坐標，繪制標準曲線。
1.5 數據庫的建立
按優化的色譜條件進樣，對目標化合物進行TOF-Scan 全掃描，利用定性分析軟件Mass Hunter Qualitative Analysis 對結果進行分析，獲得目標物的保留時間、分子式、母離子、質量偏差及單一同位素準分子離子的質子化方式等信息，建立目標化合物一級精確質量數據庫。利用targeted MS/MS 采集模式，在不同碰撞能量下采集一級數據庫中目標物精確質量的母離子，獲得碎片離子質譜圖，導入PCDL 軟件，并編輯對應目標化合物二級離子信息，建立適用于多農藥殘留非靶向篩查的二級離子質譜庫。
2 結果與討論
2.1 凈化劑的優化
QuEChERS 方法是利用吸附劑填料與基質中的雜質相互作用，通過分散固相萃取(DSPE) 達到除雜凈化的目的。本研究選用15 種具有代表性的農藥作為前處理方法開發的研究對象，其中按化合物種類包括三嗪類農藥 (如莠滅凈)、酰胺類農藥 (如苯霜靈)、氨基甲酸酯類農藥 (如戊草丹)、有機磷類農藥 (如喹硫磷) 和嘧啶類農藥 (如嘧菌胺) 等農藥類型；按功能分類包括除草劑、殺菌劑、殺蟲劑和殺螨劑等，從化合物種類和功能性上均具有代表性，且這15 種農藥性質穩定，可有效提高方法優化的可靠性。針對香櫞基質提取物中含有的糖類、有機酸、色素、脂類等物質，考察了3 組凈化劑組合的凈化效果：組合1 為：PSA 150 mg，GCB 15 mg，MgSO4900 mg；組合2 為：PSA 150 mg，C18150 mg，MgSO4900 mg；組合3 為：PSA 300 mg，C18300 mg，MgSO4900 mg，GCB 90 mg，硅膠300 mg。結果 (圖1) 表明：組合3 處理后的樣品平均回收率為102%，組合1 的為96%，組合2 的為108%，其中組合3 處理后回收率在70%～120% 范圍的農藥數占93%，組合1 為80%，組合2 為67%。故最終選擇組合3 作為凈化吸附劑。
圖1 不同凈化方式對香櫞中15 種農藥回收率的影響Fig. 1 Effects of cleanup sorbent combinations on recoveries of 15 pesticides in Fructus Citri
2.2 凈化方法的比較
對QuEChERS 法和固相萃取法 (SPE) 兩個前處理方法進行了對比研究。結果 (圖2) 表明：固相萃取法凈化所得樣品上機液呈淡黃色，且糖類及揮發油類凈化不完全，15 種化合物的平均回收率為84%，較QuEChERS 法結果偏低，可能是由于基質中雜質干擾的原因。最終選擇QuEChERS凈化方式。
2.3 篩查方法的優化
樣品按優化后的方法進行前處理，采用TOFScan 模式在不同碰撞能量下進行全掃描，通過Mass Hunter Qualitative Analysis 中的 “Find Compounds by Formula” 算法自動分析采集的原始數據，提取其離子流色譜圖 (EICs) 中每個可能的母離子及其在指定色譜保留時間范圍內的碎片離子信息，分析其中可能存在的化合物，通過與已建立的180種農藥PCDL 數據庫進行自動檢索，列出與數據庫中目標化合物的精確質量數偏差 ± 10 ppm、保留時間偏差 ± 0.25 min、且加權匹配得分≥70 的疑似陽性結果，將疑似結果與二級質譜庫進行匹配，利用碎片離子及其豐度比二次確證，若匹配得分大于70，則完成目標化合物的篩查識別與確證。如表2 所示，利用上述條件對1 批香櫞樣品進行篩查，結果共篩查出9 種化合物，其中氟甲喹、西瑪津、滅害威和氟環唑未檢測到其碎片離子信息，得分均小于70，則被判定為假陽性結果。
表2 香櫞樣品定性篩查結果Table 2 Qualitative screening results of Fructus Citri sample
采用上述自動篩查流程，對空白基質添加樣品依據各個化合物的保留時間、化合物離子信息庫，結合篩查參數進行非靶向定性匹配。為提高篩查效率，保證篩查結果的準確性，需對質量數提取窗口、保留時間窗口及峰面積閾值等篩查檢索參數進行優化。
2.3.1 精確質量數提取窗口 精確質量偏差是理論值與實際測定值之間的差異，因此，精確質量數提取窗口也是化合物準確定性的重要依據之一。設置了 ±10 ppm、±30 ppm、±100 ppm 3 組質量數提取窗口。 結果顯示：在一定的保留時間窗口及絕對峰面積范圍內，質量數提取窗口為 ±10 ppm時，同一添加水平的化合物中未檢出的化合物數量明顯多于其他兩組，以添加水平為0.05 mg/kg的乙螨唑為例，結果見圖3：3 組質量數提取窗口提取m/z= 304.11322 的離子峰型差異較大，在± 100 ppm 時，干擾峰的出現會造成假陽性化合物的出現，考慮到雖然較低的質量數偏差可有效降低背景干擾，但同時也增大了假陰性的可能性，而較大的質量數偏差卻降低了定性篩查質量準確度，綜合考慮，將精確質量數窗口設置為 ± 30 ppm。
圖3 不同精確質量數窗口下提取乙螨唑 (m/z = 304.113 22) 離子的結果Fig. 3 Extracted ion chromatogram of etoxazole at different mass width (m/z = 304.113 22)
2.3.2 保留時間窗口 精確的保留時間可有效區分同分異構體和同量異位素化合物，從而提高篩查分析的效率。優化了不同保留時間窗口(0.15、0.25、0.35、0.45 和0.55 min) 對檢索結果的影響。結果發現：當保留時間窗口低于0.35 min時，多數化合物無法被檢索出，造成假陰性結果增多，但隨著時間窗口的增大，同一時間窗口內檢出多個干擾色譜峰，又會造成化合物假陽性篩查數量增多。綜合考慮，選擇0.35 min 為保留時間窗口。
2.3.3 絕對峰面積閾值 準確的定量結果要求化合物色譜峰峰形好，分離度高，在定性匹配時避免提取背景和干擾離子。對比不同峰面積閾值(1000、3000、5000 和10000) 的結果顯示，過大的峰面積閾值會增加假陰性樣品的數量，對于響應值較低的化合物易出現漏篩現象。而當峰面積閾值小于3000 時，篩查結果中假陽性化合物數量也會明顯增多，因此選擇絕對峰面積3000 和相對峰面積≥ 0.1%作為提取未知物色譜峰的閾值。
2.4 基質效應
基質效應(Me) 是目標化合物離子化過程中受到基質共提物影響，導致化合物響應信號的增強或抑制。依據不同化合物的響應值高低，配制了0.005～0.1 mg/kg 范圍的純溶劑標準溶液及基質標準溶液，通過對比目標物在純溶劑與基質溶液中的峰面積比值，判斷基質效應的強弱。Me< 80%為基質抑制效應，80%
2.5 方法的線性范圍、篩查限及定量限
結果表明：除涕滅威、氟甲喹和磺酰草吡唑外，其他目標化合物在0.005～1.0 mg/L 質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數 (r) 均≥ 0.99。
參照歐盟標準SANTE/12682/2019[12]，篩查限(SDLs) 是指同一農藥在95%的添加樣品中均被檢出的最低含量。在分析的180 種農藥中，其中有99 種 (55.0%) 化合物能夠在0.005 mg/kg 的含量水平中被檢出，則SDLs 均 ≤ 0.005 mg/kg，有67種 (37.2%) 和8 種 (4.4%) 農藥分別在0.01 mg/kg和0.02 mg/kg 的含量水平中被檢出，對應的SDLs 分別為0.005～0.01 mg/kg (含0.01 mg/kg) 和0.01～0.02 mg/kg (含0.02 mg/kg) ，僅保棉磷、異柳磷、菜草畏、氧特丁硫磷砜、磺酰草吡唑和涕滅威6 種農藥 (3.3%) 因響應較差而未能均在95%的添加樣品中檢出，由此推斷這些農藥在該方法中的SDLs > 0.05 mg/kg。通過對比歐盟MRL 標準中的限量值范圍，本方法所建立的SDL 值均能滿足中國、歐盟等國家或組織對香櫞中大多數農藥的最大殘留限量檢測要求。
按信噪比大于10 對應的添加水平作為定量限(LOQ)，則有44 種 (24.4%) 化合物的LOQ 為0.005 mg/kg，104 種 (57.8%) 化合物的LOQ 為0.01 mg/kg，26 種 (14.4%) 化合物的LOQ 為0.02 mg/kg，6 種 (3.3%) 化合物的LOQ 為0.05 mg/kg。
2.6 方法的正確度及精密度
參照《中國藥典》(2020 版) 通則中33 種禁用農藥的定量限在0.01～0.2 mg/kg 之間[5]，驗證0.02、0.05 和0.1 mg/kg 3 個添加水平下180 種農藥的正確度及精密度，每個添加水平重復5 次。結果顯示：在3 個添加水平下180 種農藥的平均回收率分別為58%～129%，68%～131%和66%～132%，其中87.2%的農藥平均回收率在70%～120%之間，且RSD 為0.7%～18%。由于凈化劑GCB 對其具有較強的吸附作用 (如喹氧靈)，或是酰嘧磺隆等磺酰脲類農藥為弱酸性化合物，在酸性較高的香櫞基質中易發生降解，造成回收率降低 (低于70%)；回收率高于120%的農藥，可能是由于前處理過程中雜質凈化不完全，對農藥的提取率造成了干擾，導致回收率較高。
2.7 實際樣品的檢測
利用本方法對市售的50 批香櫞樣品中180 種農藥殘留進行了檢測。結果顯示：有7 份樣品檢出農藥13 種，檢出率為7.2%。所有檢出農藥共流出離子及其豐度比與譜庫信息相一致，對比標準品數據庫，參考碎片離子質譜圖，匹配度均大于70%。以甲拌磷亞砜為例，實際樣品檢出農藥的色譜及碎片離子圖如圖4 所示。采用基質匹配校準曲線對篩查出的農藥進行定量分析，同時采用超高效液相色譜質譜聯用儀 (UPLC-MS/MS) 對篩查和定量結果進行比對，結果如表3 所示：UPLC-Q-TOF/MS 法和UPLC-MS/MS 法測定結果相近 (相對誤差< 23.7%) ，其中，甲拌磷(含甲拌磷砜、甲拌磷亞砜)含量分別為0.2595 和0.2314 mg/kg，超出其《中國藥典》 2020 年版) 中的限量規定(0.02 mg/kg) ；氟啶蟲胺腈含量分別為0.5062 和0.4985 mg/kg，超出其歐盟最大殘留限量標準(0.4 mg/kg)；其他檢出農藥含量均未超過歐盟限量標準。
圖4 檢出樣品中甲拌磷亞砜的色譜圖和質譜圖Fig. 4 Chromatogram and mass spectra of phorate sulfoxide in positive sample
表3 實際樣品檢測結果Table 3 Sample test results
3 結論
本文建立了香櫞中180 種農藥的QuEChERS結合超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜檢測方法，通過優化前處理條件及飛行時間質譜篩查過程中的精確質量數提取窗口、保留時間窗口及絕對峰面積閾值等參數，利用建立的精確質量數據庫及高分辨碎片離子譜圖庫，實現了香櫞中多種農藥殘留的快速非靶向篩查和準確定量。與傳統的液相色譜-串聯質譜法相比，該法具有高通量、高效率及高靈敏度等優點，篩查無假陽性，而且定量結果準確可靠，在中藥材非靶向目標化合物和高通量多農殘快速篩查方面具有較高的應用價值。
