嘧菌酯/聚丙烯腈微球的制備及緩釋性能

張鐘凱, 應(yīng)彩嬌, 程志強, 于曉斌

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，長春 130118；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，長春 130118)

嘧菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，具有滲透性強、殺菌譜廣等特點，是中國目前登記條目最多的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[1]。但是，嘧菌酯傳統(tǒng)劑型如懸浮劑(SC)、水分散粒劑 (WG) 等在兌水噴霧時會由于霧滴蒸發(fā)漂移、彈跳碎裂等因素，導(dǎo)致有效成分利用率低，持效期短[2-3]。農(nóng)藥緩控釋制劑可以避免這些弊端，其中農(nóng)藥微球具有靶向給藥、控制釋放、減少用量等特點，已被廣泛研究[4]。農(nóng)藥微球是主要依靠載體材料對農(nóng)藥活性成分進(jìn)行調(diào)控或修飾而實現(xiàn)緩釋功能的，因此載體材料的選擇至關(guān)重要[5-6]。

聚丙烯腈 (polyacrylonitrile, PAN) 具有熔點較高、耐溶劑性等優(yōu)點，是一種優(yōu)良的載體材料。以PAN 為原料制備的微球具有良好的形貌，可作為靶向藥物載體[7]。而目前常用的微球制備工藝如溶劑揮發(fā)法、化學(xué)交聯(lián)法、噴霧干燥法等，盡管其所制備的微球粒徑均一，緩釋效果良好，但是存在反應(yīng)條件復(fù)雜、操作難度大等問題[8-10]。

靜電噴霧技術(shù)操作簡單、成本低廉，用其制備的功能性微球已應(yīng)用于醫(yī)療、環(huán)境保護(hù)和能源等領(lǐng)域[11-13]。目前國內(nèi)外尚未見將靜電噴霧技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究，究其原因為靜電紡絲存在著產(chǎn)量低的弊端，但是隨著近年來靜電噴霧技術(shù)的不斷發(fā)展，已出現(xiàn)如雙射流、多射流等靜電噴霧方式用以提高生產(chǎn)效率[14]，使得這一技術(shù)有望應(yīng)用在農(nóng)藥生產(chǎn)上。

本研究以PAN 為載體，采用靜電噴霧技術(shù)[15]制備了嘧菌酯/PAN 微球，并討論了工作電壓對嘧菌酯/PAN 微球粒徑的影響，以及嘧菌酯與PAN質(zhì)量比對載藥微球粒徑、包封率等性能的影響，同時探究了載藥微球在不同pH 條件下的緩釋性能。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑、儀器及植物病原菌

97%嘧菌酯 (azoxystrobin) 原藥，由蘇州甫路生物科技有限公司提供；25% 嘧菌酯懸浮劑(azoxystrobin 25% SC) ，由先正達(dá)投資有限公司提供；聚丙烯腈粉末 (PAN，Mr=15000)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF，純度99.8%)，由上海市化學(xué)試劑采購供應(yīng)站提供；分析純磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和色譜純乙腈，購于北京化工廠；分析純檸檬酸鈉(TC)，購于天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；吐溫80，由江蘇省海安石油化工公司提供。

WL-1 靜電紡絲機，由北京艾伯智業(yè)離子技術(shù)有限公司生產(chǎn)；SS-550 型掃描電子顯微鏡(SEM)，由日本島津公司生產(chǎn)；1200 系列高效液相色譜儀，由安捷倫科技有限公司生產(chǎn)。

黃瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare(Berk.&Mont.) Arx，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院于黃瓜感病植株的葉片上分離得到并鑒定。

1.2 嘧菌酯/PAN 微球的制備

稱取0.200 g PAN 置于樣品瓶中，加入10 mL DMF，擰緊瓶蓋，用恒溫磁力攪拌器于50 ℃下攪拌溶解0.5 h，放入超聲波清洗器中超聲振蕩10 min，靜置，得到質(zhì)量濃度為2%的PAN 溶液；然后將一定質(zhì)量的嘧菌酯原藥加入到上述PAN 溶液中，攪拌至溶解得到樣品溶液。在40 ℃下，用5 mL注射器吸取上述樣品溶液，將注射器固定在靜電紡絲機的注射泵上，電場發(fā)生器正極連接注射器金屬針頭，攪拌器機金屬桿連接負(fù)極，使整個裝置形成如圖1 所示的靜電場[16]。設(shè)定好各種參數(shù)后，啟動注射泵，在靜電力和注射泵推力的作用下，液滴形成細(xì)小微球。試驗結(jié)束后，收集嘧菌酯/PAN 微球備用。

圖1 靜電噴霧實驗裝置圖Fig. 1 Diagram of electrostatic spray experimental device

1.3 制備條件對嘧菌酯/PAN 微球性能的影響

設(shè)定靜電紡絲機工作電壓分別為13、14 和15 kV，推進(jìn)速率1.25 mL/h，工作距離20 cm，以DMF 為溶劑配制質(zhì)量濃度2%的 PAN 溶液進(jìn)行靜電噴霧，得到嘧菌酯/PAN 微球[m(嘧菌酯) :m(PAN) = 2 : 1]，收集待測。

分別設(shè)定m(嘧菌酯) :m(PAN) = 1 : 2、1 : 1 和2 : 1，配制2% PAN 溶液，在推進(jìn)速率1.25 mL/h、工作距離20 cm 及電壓15 kV 的工藝條件下進(jìn)行靜電噴霧，得到嘧菌酯/PAN 微球，收集待測。

1.4 嘧菌酯/PAN 微球性能測定

1.4.1 微球形貌特征 采用掃描電子顯微鏡觀察嘧菌酯/PAN 微球的形貌，掃描電壓為5～10 kV。用Nano measurer 1.2 軟件測量嘧菌酯/PAN 微球的直徑。

1.4.2 包封率與載藥量 稱取嘧菌酯/PAN 微球30 mg，置于試管中，加入3 mL 無水乙醇，室溫下浸泡、超聲10 min，之后在轉(zhuǎn)速6000 r/min 下離心8 min。吸取上清液，用高效液相色譜 (HPLC)外標(biāo)法測定上清液中嘧菌酯的含量。

HPLC 色譜條件：Pgrandsll-STG-C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流動相V(乙腈) :V(水) =70 : 30，流速為1 mL/min，檢測波長為245 nm，進(jìn)樣量為10 μL，檢測器溫度是25 ℃。

分別按公式 (1) 與 (2) 計算載藥量(LC)與包封率(EE)[17]。

其中：ma為實際測得的載藥微球中嘧菌酯的質(zhì)量，mg；mt為載藥微球中理論嘧菌酯的質(zhì)量，mg；mb為干燥載藥微球的質(zhì)量，mg。

1.4.3 緩釋性能研究方法 采用透析法[18]研究載藥微球分別在pH 5、7 和8 的磷酸鹽緩沖溶液中的釋藥行為。緩沖溶液的配制方法見表1。

表1 不同pH 值磷酸鹽緩沖溶液的配制Table 1 Preparation of phosphate buffer solutions with different pH

試驗于25 ℃下進(jìn)行。稱取一定質(zhì)量的載藥微球于透析袋 (MD 44；Mw= 7000) 中，分別在1、4 和7 h 后取3 mL 釋放溶液進(jìn)行分析，每次取出溶液后立即用相同體積的新鮮緩沖溶液替換，用以維持緩沖溶液的體積恒定。在與1.4.2 節(jié)相同的色譜條件下測定釋放溶液中嘧菌酯的含量，并以釋放時間為橫坐標(biāo)，累積釋放量為縱坐標(biāo)，得到載藥微球中嘧菌酯的釋放曲線。用相同的方法研究嘧菌酯原藥的釋放曲線。其中，藥物累積釋放量按(3)式計算。

其中：Qc為嘧菌酯累積釋放率，% ；Cn為第n次取樣時溶液中嘧菌酯的質(zhì)量濃度，mg/L；Ci為第i次取樣時溶液中嘧菌酯的質(zhì)量濃度， mg/L；V為釋放介質(zhì)的總體積(300 mL)；Vm為每隔一段時間內(nèi)取出的釋放溶液體積(3 mL)；m為樣品中總嘧菌酯含量，mg。

1.5 室內(nèi)盆栽試驗

根據(jù)室內(nèi)試驗確定25%嘧菌酯懸浮劑的最佳施藥濃度為有效成分0.2 g/L，配制該濃度的藥液。稱取適量嘧菌酯/PAN 微球，以蒸餾水為溶劑，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的吐溫80 為分散劑，配制有效成分質(zhì)量濃度分別為0.2、0.3 和0.4 g/L 的嘧菌酯/PAN 微球懸浮劑，待用。

選取36 株長勢相似的黃瓜幼苗移栽至塑料花盆中，分為6 組，在相同且適宜的環(huán)境條件下每天噴適量清水1 次。待移栽成活后，取適量黃瓜炭疽病菌孢子用無菌水稀釋至3 × 107個孢子/mL，其中1 組黃瓜幼苗未噴孢子懸浮液 (陰性對照組) ，其余5 組均勻噴霧上述孢子懸浮液，然后置于25 ℃環(huán)境中，前12 h 黑暗保存，濕度保持在90% 以上，隨后在光照與黑暗各12 h 的條件下培養(yǎng)，在發(fā)病初期進(jìn)行以下5 個處理：清水處理 (對照組，CK ) ，有效成分0.2 g/L 的25%嘧菌酯懸浮劑，有效成分0.2、0.3 和0.4 g/L 的嘧菌酯/PAN 微球懸浮劑，藥劑處理均噴霧至藥液剛好濕潤葉片呈滴落狀態(tài)，試驗過程中每組黃瓜幼苗每天噴適量清水以保持黃瓜幼苗活性，試驗重復(fù)6 次，每7 d觀察1 次，共觀察2 次，調(diào)查病情指數(shù)并按(4)式計算藥劑防治效果[19-20]。

其中：P為防治效果，W0為對照組病情指數(shù)，Wt為藥劑處理后t時刻的病情指數(shù)。

數(shù)據(jù)通過IBM SPSS Statistics 25 軟件進(jìn)行分析，用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 靜電紡絲機的工作電壓對載藥微球形貌與粒徑的影響

采用靜電噴霧技術(shù)制備載藥微球時，不同工作電壓下微球的形貌和粒徑分布如圖2 所示。由圖2A～2C 看出：在3 種工作電壓下載藥微球在形貌上保持了良好的完整性，微球表面光滑，無明顯的空洞和褶皺。由圖2a～2c 可以看出：在13、14 和15 kV 工作電壓下，其粒徑分別為 (1.32 ±0.08)、 (1.17 ± 0.10) 和 (0.86 ± 0.08) μm，即載藥微球粒徑隨著工作電壓的增大而減小。這可能是因為當(dāng)靜電噴霧液的表面靜電斥力增加時，對射流的拉伸作用更加劇烈，液滴被進(jìn)一步拉伸導(dǎo)致粒徑減小。

圖2 工作電壓分別在13、14 和15 kV 下載藥微球SEM 圖(A～C)和粒徑分布(a～c)Fig. 2 The SEM images(A-C) and particle size distribution(a-c) of the microspheres recorded under the working voltages of 13, 14 and 15 kV

2.2 嘧菌酯與PAN 質(zhì)量比對載藥微球性能的影響

由表2 數(shù)據(jù)可知：嘧菌酯與PAN 的質(zhì)量比對微球粒徑的影響不明顯，但會顯著影響載藥量和包封率。隨著嘧菌酯與PAN 質(zhì)量比的增加，載藥微球載藥量逐漸增大，包封率逐漸減小，這是由于嘧菌酯含量增加所致；相反，隨著PAN 比例增加，PAN 對于嘧菌酯的吸附能力增強，載藥微球包封率隨之增大，但會導(dǎo)致載藥量減小。由于包封率代表藥物的利用情況，生產(chǎn)中較為重要，因此本研究選擇m(嘧菌酯) :m(PAN) = 1 : 2 為最佳比例。

表2 嘧菌酯與PAN 質(zhì)量比對載藥微球的影響Table 2 Influence of the mass ratio of azoxystrobin and polyacrylonitrile on drug-loaded microspheres

2.3 不同pH 值緩沖溶液中嘧菌酯/PAN 微球的緩釋性能

如圖3 所示，嘧菌酯原藥在pH 5、7 和8 的磷酸鹽緩沖溶液中60 min 時嘧菌酯的累積釋放量分別為80%、75%和70%，已基本完全釋放，而相同條件下載藥微球中的嘧菌酯由于PAN 吸附作用僅釋放了18%、50%和58%；400 min 時載藥微球分別釋放97%、87%與69%，即在堿性溶液中釋放速率更低，說明載藥微球具備一定的抗酸堿能力以及良好的緩釋性能。

圖3 不同pH 緩沖溶液中的累積釋藥曲線Fig. 3 Cumulative release curve in buffer solutions with different pH

2.4 盆栽試驗結(jié)果

盆栽試驗結(jié)果(表3) 表明，有效成分0.3 和0.4 g/L 的嘧菌酯/PAN 微球懸浮劑與0.2 g/L 的25%嘧菌酯懸浮劑對黃瓜炭疽病的防治效果無顯著性差異。處理14 d 后25%嘧菌酯懸浮劑的防治效果相較于7 d 前下降了25.12%，而有效成分0.3 和0.4 g/L 嘧菌酯/PAN 微球懸浮劑的防治效果僅僅分別下降了15.71%和12.40%，說明嘧菌酯/PAN 微球懸浮劑具有緩慢釋放嘧菌酯的能力；但是有效成分0.2 g/L 的嘧菌酯/PAN 微球懸浮劑防效較差，可能是由于PAN 比例較高，吸附作用較強導(dǎo)致負(fù)載在微球上的嘧菌酯不能完全釋放。從經(jīng)濟效益上考慮，本研究推薦嘧菌酯/PAN 微球懸浮劑施用質(zhì)量濃度為0.3 g/L。14 d 后各處理下黃瓜幼苗生長情況見網(wǎng)絡(luò)版附加材料。

表3 不同劑型嘧菌酯對黃瓜炭疽病的防治效果Table 3 Control efficacy of azoxystrobin with different formulations on cucumber anthracnose

3 結(jié)論

本研究通過靜電噴霧技術(shù)制備了嘧菌酯/PAN微球。在靜電噴霧工作電壓15 kV、工作距離20 cm、PAN 質(zhì)量濃度2%、m(嘧菌酯) :m(PAN) =1 : 2 和進(jìn)樣速率1.25 mL/h 的工藝條件下，制備得到了嘧菌酯/PAN 微球。微球粒徑為(0.89 ± 0.09) μm，包封率79.78%，載藥量26.59%。緩釋試驗結(jié)果表明，載藥微球具備抵御外界酸堿壞境的能力，能夠?qū)崿F(xiàn)嘧菌酯的長效穩(wěn)定釋放；室內(nèi)盆栽試驗表明，嘧菌酯/PAN 微球懸浮劑對黃瓜炭疽病具有長效的治療作用，其最佳施用有效成分質(zhì)量濃度為0.3 g/L。總體來說，以PAN 為載體使用靜電噴霧技術(shù)可以制備出微米級的微球，并實現(xiàn)對嘧菌酯的負(fù)載，本研究對于嘧菌酯緩釋劑型的研究具有一定的參考價值。