高效陰離子交換-積分脈沖法檢測氨基寡糖素農藥中游離氨基葡萄糖

陳煒瑤, 吳國權, 李 彬, 高凡欽

(1. 廣西中醫藥大學，南寧 530000；2. 梧州市食品藥品檢驗所，廣西 梧州 543000；3. 賽默飛世爾科技 (中國)有限公司，上海 200135)

氨基寡糖素又稱殼寡糖，是指D-氨基葡萄糖(GIcN) 以β-1,4 糖苷鍵連接的低聚糖，是一種低毒殺菌劑，可對多種病原菌的生長產生抑制作用，如影響真菌孢子萌發、誘發菌絲形態發生變異、使菌絲細胞內的生化反應發生改變等。此外，氨基寡糖素還能激發植物體內的基因表達，產生具有抗病作用的幾丁質酶、葡聚糖酶、植保素及PR 蛋白等，并具有細胞活化作用，有助于受害植株的恢復，促根壯苗，增強作物的抗逆性，促進植物生長發育[1-2]。

氨基寡糖素同時具有殺菌及營養功能，使用過程中具有高效、低成本、無公害等特點，對中國農業可持續性發展具有重要意義，因此農業部2016年下發了關于氨基寡糖素母藥 (NY/T 2889.1—2016) 及水劑 (NY/T 2889.2—2016) 質量的相關標準[3-4]，標準中對游離的氨基葡萄糖的限量作了明確規定。目前，國內外對氨基寡糖素中游離氨基葡萄糖的定量方法研究報道相對較少。李娟等[5]采用CarboPacPA10 分離了氨基寡糖素與氨基葡萄糖，但氨基葡萄糖易受到殼四糖與殼三糖的干擾，分離度達不到要求，定量容易受到干擾，尤其是在游離氨基葡萄糖含量較低時；劉艷霞[6]采用分光光度法檢測了氨基寡糖素水劑中有效成分氨基寡糖素的含量，邵波等[7]采用離子色譜法快速檢測了氨基寡糖素的含量，但并未對游離氨基葡萄糖進行定量研究。為解決氨基寡糖素與氨基葡萄糖之間分離度低的問題，本研究采用高效陰離子交換-積分脈沖法，在分析柱DionexCarboPac PA100 前添加一個氨基保護柱，利用氨基寡糖素與氨基葡萄糖分子中所帶的氨基數量不同導致在氨基捕獲柱上保留行為差異的特點，嘗試將氨基葡萄糖與氨基寡糖素進行分離，并對其中的游離氨基葡萄糖進行了定量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo ScientificTMDionexTMICS-6000 離子色譜系統，包括：ICS-6000 四元梯度泵模塊、ICS-6000 DC 模塊 (含安培檢測器) 、工作電極Au、參比電極Ag/AgCl；Thermo ScientificTMDionexTMAS-AP 自動進樣器；Thermo Scientific? Dionex?Chromeleon? 色譜工作站。

氨基葡萄糖標準品 (純度≥98%，BOC Sciences) ；質量分數為50%氫氧化鈉溶液 (美國Fisher 公司) ；氨基寡糖素母藥 (純度≥85%，深圳諾普信農化股份有限公司) 。

1.2 色譜條件

保護柱：DionexCarboPac PA100，4 mm ×50 mm；分析柱：DionexCarboPac PA100，4 mm ×250 mm；氨基捕獲柱：DionexAminoTrap Column，4 mm × 50 mm。柱溫30 ℃；檢測器箱控溫30 ℃；定量環25 μL；安培檢測器；工作電極：Au；參比電極：Ag/AgCl；波形：標準四電位波形。淋洗液及梯度條件見表1。

表1 淋洗液梯度程序Table 1 Eluent gradient program

2 結果與分析

2.1 氨基捕獲柱對主成分及目標物保留行為的影響

由于氨基葡萄糖與氨基寡糖素均帶有羥基及氨基，在以陰離子的形式分離以上目標物時，受氨基基團的影響，氨基葡萄糖與氨基寡糖素之間的分離度較差 (見圖1，加氨基捕獲柱前) 。由于普通樣品中游離氨基葡萄糖含量相對較低，因此，采用該方法測定會影響對游離氨基葡萄糖定量的準確性。利用氨基寡糖素及游離氨基葡萄糖所攜帶的氨基數量不同的特點，在分析系統中增加一個氨基捕獲柱，可以增強攜帶氨基基團較多的氨基寡糖素在氨基捕獲柱上的保留，而氨基葡萄糖只含有一個氨基，在捕獲柱上保留相對較弱，可快速地從保護柱上洗脫出，從而實現氨基葡萄糖與氨基寡糖素之間的分離 (見圖1，加氨基捕獲柱后) ，故采用此方法可消除氨基寡糖素對氨基葡萄糖的干擾，提高氨基葡萄糖定量結果的準確性。

圖1 分析系統中增加氨基捕獲柱前(A)后(B)對比圖Fig. 1 The comparison diagram before(A) and after(B)adding an amino trap column in the analysis system

2.2 柱溫的優化

柱溫對目標物與雜質的分離也會產生影響。本方法比較了分別在25、30、35、40 和45 ℃柱溫條件下氨基葡萄糖與雜質的分離效果，結果 (圖2)表明，氨基葡萄糖會受到雜質1 及雜質2 的干擾。隨著柱溫的升高，目標物游離氨基葡萄糖的保留時間縮短。在柱溫25 ℃時樣品中雜質1 與目標物無法完全分離；柱溫為30 ℃時，雜質1 的保留弱于目標物；隨著柱溫升高，雜質1 與氨基葡萄糖分離度變大，但樣品中雜質2 會干擾目標物。綜合考慮，最終選擇30 ℃作為分析時的柱溫。

圖2 不同柱溫下氨基葡萄糖與雜質離子分離圖譜Fig. 2 Separation spectrum of glucosamine and impurity ions at different column temperatures

2.3 洗脫程序的優化

本方法是采用前段先等度洗脫，待目標物游離氨基葡萄糖被洗脫后，再加大淋洗液氫氧化鈉溶液的濃度，將氨基寡糖素沖出色譜柱。圖3 是對比前段不同濃度氫氧化鈉溶液對目標物及雜質分離的影響。可見：隨著氫氧化鈉濃度的增加，氨基葡萄糖與雜質2 的分離度變大，但與雜質1 的分離度變小。當氫氧化鈉溶液濃度為22 mmol/L時，雜質1 基本上全被包裹到目標峰內。綜合考慮最佳分離度，確定前段等度洗脫的氫氧化鈉的濃度在15～20 mmol/L 之間，故本方法采用濃度為17 mmol/L 的氫氧化鈉溶液作為洗脫游離氨基葡萄糖的淋洗液。

圖3 不同淋洗液(氫氧化鈉溶液)濃度下氨基葡萄糖與雜質分離圖譜Fig. 3 The separation of glucosamine and impurities with different eluent (sodium hydroxide solution) concentrations

2.4 線性范圍、檢出限及定量限

在選定的色譜條件下依次分析系列標準溶液，以各離子的色譜峰面積對濃度做標準曲線。結果顯示：氨基葡萄糖在0.02～10 mg/L 范圍內，色譜峰面積與藥劑濃度間具有良好的線性關系，標準曲線方程為y= 4.2267x?0.0392，相關系數(r)為0.999 9。定量限(LOQ)為0.02 mg/L；以信噪比 (S/N) 為3計算得到檢出限(LOD)為0.01 mg/L。

2.5 方法應用

在選定的色譜條件下，對市售氨基寡糖素農藥母藥及水劑樣品進行平行分析，結果見表2。母藥及水劑平行測試的相對標準偏差均小于1.9%，證明該方法在實際樣品測定時具有較高的穩定性。

表2 氨基寡糖素母藥及水劑樣品分析結果Table 2 Analysis results of the amino-oligosaccharin technical concentrates and aqueous solution samples

依次向氨基寡糖素母藥及水劑樣品中加入低、中、高3 個水平的氨基葡萄糖標準品，進行添加回收試驗。每個水平平行測定3 次。結果 (表3) 顯示，氨基葡萄糖的平均添加回收率在90%～99%之間，RSD 在0.75%～1.9%之間，證明該方法在實際樣品測定時具有較高的準確性。

表3 氨基寡糖素母藥及水劑樣品添加回收結果Table 3 The spiked recoveries for amino-oligosaccharin technical concentrates and aqueous solution

3 結論

本研究建立了高效陰離子交換-積分脈沖檢測氨基寡糖素母藥及水劑中游離氨基葡萄糖的方法，在保護柱DionexCarboPac PA100 前加裝氨基捕獲柱，利用氨基葡萄糖與氨基寡糖素所帶氨基數量不同，導致在氨基捕獲柱上的保留行為差異，可以使氨基葡萄糖與氨基寡糖素完全分離，使氨基寡糖素母藥及水劑中的游離氨基葡萄糖檢測結果更加準確可靠，從而更加準確地判斷氨基寡糖素的含量。該方法具有操作步驟簡單、分離效果好、通用性強、準確度和靈敏度高等優點，更適用于氨基寡糖素母藥及水劑中游離氨基葡萄糖的快速定性和定量檢測，也可為游離氨基葡萄糖在其他種類樣品中的定性和定量檢測提供參考。