基于網絡藥理學探討艾柱燃燒產物保護視網膜損傷的機制

陳如一， 郭 璐， 李萱儒， 徐心如， 夏道宗

(浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053)

近年來，人們在液晶顯示終端上所花費的時間日益增長，發光二極管作為液晶顯示屏中主要的背光源，在工作的過程中會發出大量藍光，進而損傷視網膜。視網膜損傷的病理基礎主要是基于視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)細胞功能的紊亂、退化和死亡[1]，一方面RPE細胞作為血-視網膜外屏障的重要組成部分，承擔著視網膜代謝物質轉運、光感受器外節段降解以及保護視網膜免受光損害等重要作用；另一方面，RPE細胞作為人體內耗氧量最大的組織之一，維持其所在部位的氧化還原穩態至關重要[1-2]，但藍光輻照使RPE內部穩態被打破，體內抗氧化防御系統不足以及時清除體內由藍光誘導的過量氧自由基，進而引發了機體的氧化應激反應和視網膜損傷。

艾葉為菊科蒿屬植物艾ArtemisiaargyiLévi. et Vant.的干燥葉，艾柱是由艾葉加工的艾絨填充而成的柱狀物[3]，艾灸治療眼部疾病、緩解視疲勞自古便有應用[4]，但其具體作用機制尚不明確，藥效活性成分和核心靶點蛋白還有待探究。本課題組前期研究表明，艾柱燃燒產物含有苯酚、3-呋喃甲醇等34種成分，具有較強的抗氧化活性[5]；本研究基于網絡藥理學[6-7]，通過篩選艾柱燃燒產物活性成分作用靶點和視網膜損傷疾病靶點建立藥物-靶點-疾病網絡，并對艾柱燃燒產物保護視網膜損傷的作用機制進行初步驗證，以期為其臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 細胞株 人視網膜色素上皮細胞ARPE-19購自美國模式培養物集存庫，批號CRL-2302。

1.2 試劑與藥物 艾柱(批號20190415)購自浙江乾一生物科技有限公司。葉黃素(批號F10J10M92153)購自上海源葉生物科技有限公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清、胰酶購自美國Gibco公司；RIPA 裂解液(強)、蛋白酶抑制劑混合液、磷酸酶抑制劑混合液、BCA蛋白定量試劑盒均購自北京康為世紀生物科技有限公司；p44/42 MAPK(ERK1/2)、phospho-p44/42 MAPK(p-ERK1/2)、p38 MAPK、phospho-p38 MAPK、GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；IRDye 800 CM Goat anti-Rabbit抗體購自美國LI-COR公司。

1.3 數據庫 PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；OMIM數據庫(https://www.omim.org)；String數據庫(https://string-db.org/)；Metascape數據庫(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)。

1.4 儀器 Synergy H1型多功能微孔板檢測儀(美國BioTek公司)；W201B型數顯恒溫水浴鍋(上海申勝生物技術有限公司)；BS224S型電子天平[萬分之一，丹佛儀器(北京)有限公司]；5427R型臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；CLX-1487型雙色紅外激光成像系[基因科技(上海)有限公司]；Mini-PROTEAN Tetra Cell型垂直電泳系統(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 艾柱燃燒產物化學成分信息及靶點獲取 基于本課題組前期發現的艾柱燃燒產物化學成分信息[5]，通過PubChem數據庫獲得其對應的靶點蛋白，NCBI數據庫將其名稱轉化為基因名，整理合并后得到艾柱燃燒產物活性成分及其作用靶點。

2.2 “艾柱燃燒產物-活性成分-作用靶點”網絡構建 將篩選得到的艾柱燃燒產物活性成分和相關作用靶點分別導入Cytoscape 3.8.0軟件中，構建“艾柱燃燒產物-活性成分-作用靶點”網絡，以闡述艾柱燃燒產物物質基礎。

2.3 視網膜損傷靶點獲取 通過檢索獲得OMIM數據庫中與視網膜損傷相關的疾病靶點，取艾柱燃燒產物相關的作用靶點與視網膜損傷疾病靶點的交集，獲得艾柱燃燒產物保護視網膜損傷的潛在作用靶點。

2.4 艾柱燃燒產物活性成分-視網膜損傷-靶點網絡構建 將艾柱燃燒產物活性成分、交集靶點與視網膜損傷疾病導入Cytoscape 3.8.0軟件中，利用軟件功能構建艾柱燃燒產物活性成分-視網膜損傷-靶點網絡，在網絡中艾柱燃燒產物活性成分、視網膜損傷疾病和靶點由節點表示，節點之間的相互關系由邊表示。

2.5 蛋白相互作用(PPI)網絡構建 將艾柱燃燒產物與視網膜損傷疾病作用靶點導入String數據庫中，構建蛋白與蛋白相互作用網絡模型，選擇物種為“Homosapiens”，設定最低相互作用閾值為低置信度“low confidence(0.150)”，其余參數保持默認設置，最終獲得蛋白相互作用網絡圖。

2.6 GO、KEGG富集分析 將艾柱燃燒產物與視網膜損傷疾病作用靶點導入Metascape數據庫，設置物種為“Homosapiens”，進行GO富集分析(包括生物過程、細胞組分、分子功能，P≤0.01)和KEGG信號通路分析(P≤0.05)。通過GO富集分析得到3個部分數據繪制柱狀圖，KEGG通路富集分析獲取艾柱燃燒產物保護視網膜損傷疾病相關通路，并繪制KEGG氣泡圖，節點大小表示富集到的靶點數量，P值越小，信號通路可信度越高。

2.7 分子對接技術預測艾柱燃燒產物活性成分與潛在靶點結合能力 通過PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)獲得目標蛋白3D結構(PDB格式)，設置物種為“Homosapiens”，從TCMSP數據庫獲取潛在活性化合物的3D結構(mol2格式)。利用PyMOL軟件(www.pymol.org)去除蛋白質上的溶劑和配體，Autodock tools 1.5.6、Autodock_vina軟件進行分子對接，其結果以結合自由能的高低作為活性物質與蛋白質結合程度的評價標準，通常活性物質與蛋白質結合的構象越穩定能量越低，發生的作用可能性越大，對接結果越可靠。

2.8 細胞培養和處理 取含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養ARPE-19細胞，待細胞長到80%時用胰酶消化，取對數生長期的細胞進行后續實驗。調整細胞密度2×105/mL，鋪板或皿適應12 h后，分為5組，分別為對照組和藍光組，更換新鮮培養基培養；對照+艾柱燃燒產物組和藍光+艾柱燃燒產物組，換用含2 μg/mL艾柱燃燒產物的培養基培養；藍光+葉黃素(陽性對照)組，換用含30 μmol/L葉黃素的培養基培養。藥物預處理24 h后，在LED藍光源(430 nm、96.1 W/m2)下光照1 h，得到藍光誘導的ARPE-19細胞損傷模型，用于后續實驗。

2.9 Western blot檢測MAPK信號通路相關蛋白的表達 取對數生長期的ARPE-19細胞，接種于直徑10 cm細胞培養皿中，按“2.8”項下方法分組及處理后收集細胞，細胞裂解后提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，加入適量上樣緩沖液，100 ℃下恒溫金屬浴變性10 min，得到蛋白樣本，再進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜至PVDF膜，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加入一抗ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK，稀釋比例均為1∶1 000，置于4 ℃冰箱中，搖床上孵育過夜，以GAPDH(稀釋比例1∶5 000)為內參，TBST洗膜3次后，加熒光標記的二抗(稀釋比例為1∶10 000)，室溫下避光孵育2 h，TBST洗膜3次后，用LI-COR Odyssey CLx雙色紅外激光成像系統顯影，分析對比條帶強弱。

3 結果

3.1 艾柱燃燒產物活性成分 共得到16種艾柱燃燒產物活性成分和619個潛在作用靶點，見表1。

表1 艾柱燃燒產物活性成分Tab.1 Active MSE components

3.2 艾柱燃燒產物活性成分及其靶點相互作用的網絡圖 圖1顯示，方形陣列的為藥物作用靶點，環狀排列的為艾柱燃燒產物的活性成分，每條邊代表活性成分與靶點間的相互作用關系；艾柱燃燒產物中麥芽酚、油酸、烏洛托品等主要成分連接的靶點較多，與CASP7、RORC、CASP3、GBA等潛在靶點相互作用密切。

圖1 艾柱燃燒產物活性成分及其靶點相互作用的網絡圖Fig.1 Network diagram for interactions among active MSE constituents and their targets

3.3 視網膜損傷靶點 在OMIM數據庫中以“Retina damage”為關鍵詞進行檢索，將視網膜損傷靶點合并，剔除重復項，最終得到524個。

3.4 艾柱燃燒產物靶點與視網膜損傷相互作用的網絡圖 將619個艾柱燃燒產物活性成分靶點基因與524個視網膜損傷靶點基因取交集，得到17個艾柱燃燒產物作用于視網膜損傷的靶點。通過Cytocsape 3.8.0軟件構建艾柱燃燒產物靶標與視網膜損傷相互作用的網絡，見圖2，其中圓形(藍色)代表疾病，正六邊形(綠色)代表藥物，正三角形(黃色)代表有效活性成分，倒三角形節點(紅色)表示主要靶點，節點間相互作用關系用邊表示。由此可知，艾柱燃燒產物能通過多成分、多靶點聯合調節的方式治療視網膜損傷。

圖2 艾柱燃燒產物靶點與視網膜損傷相互作用的網絡圖Fig.2 Network diagram for interactions among MSE targets and retinal damage

3.5 PPI網絡 艾柱燃燒產物與視網膜損傷作用的相關靶點共17個，將其上傳至String數據庫，構建蛋白相互作用網絡，見圖3，其中節點表示蛋白，邊表示功能相關性，共包括17個節點、36條邊，平均節點數為4.24，平均局部聚類系數為0.732。通過基因相互連接次數選取Degree值較高者作為核心基因，前5位分別為前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2, PTGS2)、轉錄因子AP-1(transcription factor AP-1, JUN)、溶酶體酸性葡萄糖神經酰胺酶(lysosomal acid glucosyl ceramidase, GBA)、酪氨酸受體激酶(tyrosine-protein kinase Lck, LCK)、堿性磷酸酶組織非特異性同工酶(alkaline phosphatase, tissue-nonspecific isozyme, ALPL)，同時它們也是調節視網膜結構與功能的關鍵因子。

圖3 艾柱燃燒產物靶點蛋白的PPI網絡Fig.3 PPI network of MSE target protein

3.6 GO富集分析 將17個艾柱燃燒產物與視網膜損傷作用的相關靶點導入Metascape數據庫進行GO功能分析,共得到286個富集結果(P<0.01)，其中生物過程(biological process, BP)240項，主要涉及衰老、對糖皮質激素的反應、對皮質類固醇的反應、去磷酸化、對維生素D的反應等；細胞組成(cellular component, CC)9項，主要涉及轉錄因子AP-1復合體、核被膜、核纖層蛋白絲、細胞外面上細胞器、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合體等；分子功能(molecular function, MF)37項，主要涉及cAMP反應元件結合、DNA結合轉錄激活物活性，核受體的激活、轉錄因子活性，直接配體調控序列特異性DNA結合、磷酸酶激活等。根據-LogP值進行排序，分別在生物過程、分子功能、細胞組分中選出排名靠前的條目，見圖4。

圖4 GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

3.7 KEGG富集分析 利用Metascape數據庫進行KEGG富集分析，設置P<0.05，篩選出與艾柱燃燒產物保護視網膜損傷相關的信號通路，結果見圖5，可知核心靶點JUN主要富集到Th17細胞分化信號通路(圖6)。再根據P值進行排序，前20條KEGG通路及其相關信息見表2。

圖5 KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis

圖6 Th17細胞分化富集分析Fig.6 Enrichment analysis for Th17 cell differentiation

表2 KEGG通路分析(前20)Tab.2 KEGG pathway analysis(top 20)

3.8 分子對接驗證 PPI中具有較高Degree值的節點，被認為是關鍵靶點，本實驗對關鍵靶點JUN的上游蛋白ERK1/2、p38 MAPK進行研究，將兩者與16種艾柱燃燒產物活性成分進行分子對接驗證，結果見表3。就分子對接而言，結合能越小，表明活性物質與蛋白質之間結合的越牢固，其數值小于-4.25 kcal/mol時表示活性物質與蛋白質之間有一定結合活性，小于-5.0 kcal/mol時有較好的結合活性，小于-7.0 kcal/mol時有強烈的結合活性[8]。由此可知，活性成分與關鍵靶點之間的結合能介于-8.6～-3.7 kcal/mol之間，表明艾柱燃燒產物活性成分與核心靶點JUN上游蛋白之間具有較好的結合活性，預測結果可靠。選取4個對接能量較小者進行展示，結果見圖7。

圖7 艾柱燃燒產物活性成分與關鍵靶點JUN上游蛋白的分子對接模式Fig.7 Molecular docking patterns for active MSE components and upstream proteins of core JUN targets

表3 艾柱燃燒產物活性成分與核心靶點JUN上游蛋白的分子對接結果Tab.3 Molecular docking results of active MSE components and upstream proteins of core JUN targets

3.9 艾柱燃燒產物對藍光誘導ARPE-19細胞中JUN上游ERK1/2、p38 MAPK信號通路相關蛋白表達的影響 圖8顯示，與對照組比較，對照+艾柱燃燒產物組ARPE-19細胞中ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達無明顯變化(P>0.05)；經藍光照射后，ARPE-19細胞中p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白表達升高(P<0.01)；與藍光組比較，藍光+艾柱燃燒產物組和藍光+葉黃素組p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白表達均降低(P<0.05，P<0.01)。

注：A為對照組，B為對照+艾柱燃燒產物組，C為藍光組，D為藍光+葉黃素組，E為藍光+艾柱燃燒產物組。與對照組比較，**P<0.01；與藍光組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖8 艾柱燃燒產物對藍光誘導ARPE-19細胞中ERK1/2、p38 MAPK蛋白表達的影響Fig.8 Effects of MSE on protein expressions of ERK1/2 and p38 MAPK in blue light-induced ARPE-19

4 討論

近年來隨著各類電子設備的普及，視網膜損傷的發病率日益增高，表現為眼部酸脹、疼痛、視物模糊、眼睛干澀等眼部疾病，中醫稱其為“肝勞”[9]。艾灸在治療視網膜損傷方面表現出良好的受眾基礎和臨床療效。為了闡釋艾柱燃燒產物活性成分對視網膜損傷的保護作用，本研究通過網絡藥理學、分子對接、體外細胞實驗相結合的研究方法，對其可能的作用機制進行了分析。

通過綜合分析艾柱燃燒產物活性成分靶點網絡和分子對接，發現艾柱燃燒產物關鍵化合物主要為油酸、麥芽酚和烏洛托品等。其中，油酸是一種單不飽和脂肪酸，能預防由高脂血癥引起的視網膜損傷[10]；麥芽酚是一種天然的芳香化合物，具有較強的自由基清除能力，能抑制H2O2作用下NF-κB核轉錄因子的磷酸化，從而保護大鼠視網膜神經節細胞免受氧化應激的損傷[11]；烏洛托品作為一種具有抗生素活性的雜環有機化合物，可能在艾灸過程中起到一定的消毒殺菌作用[12]。

蛋白互作網絡顯示，艾柱燃燒產物保護視網膜損傷的靶點涉及CASP7、RORC、GBA、ATF6等。其中，caspase-7(CASP7)是哺乳動物細胞caspase家族中參與細胞凋亡執行的成員，在損傷誘導的RGC細胞死亡中發揮關鍵作用，抑制其活性是青光眼和其他視網膜神經退行性疾病的新治療策略[13]；維甲酸相關孤兒核受體(RORC)是一種重要的T細胞轉錄調控因子，它在實驗性自身免疫性葡萄膜視網膜炎(EAU)的進程中會發生動態甲基化改變，通過調控這種動態的甲基化過程可對其進行治療[14]；GBA是一種與帕金森疾病密切相關的基因，帕金森病患者視覺障礙與其的突變有關[15]；激活轉錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)是6種會導致全色盲(achromatopsia, ACHM)的基因之一，其突變或者多組等位基因的刪除會引發視力下降，甚至全色盲，外源性激活藥物可能通過促進ATF6從內質網到高爾基體的轉運來幫助其恢復活性，進而糾正視力損傷[16]。

通過Metascape數據庫進行KEGG信號通路富集分析，發現艾柱燃燒產物治療視網膜損傷的關鍵通路涉及Th17細胞分化、IL-17信號通路、NF-κB信號通路等。其中，Th17細胞是一種以表達轉錄因子RORC為特征的淋巴細胞亞群，在自身免疫性疾病的發生機制中發揮重要作用[17]，體外的小分子化合物能通過調節其免疫應答來誘導Treg細胞改善實驗性EAU[18]；IL-17RA作為IL-17信號通路的主要受體，當RPE細胞處于氧化應激狀態時能抑制其蛋白表達，可預防氧化應激誘導的RPE細胞凋亡和炎癥反應[19]；NF-κB是一種快速誘導的轉錄因子，在基因誘導的疾病細胞反應中發揮著廣泛作用，尤其是在免疫系統中[20]，ROS介導其激活后，可直接調控Ascl1表達和成纖維細胞重編程為化學誘導的光感受器樣細胞，在視網膜變性小鼠模型中部分恢復瞳孔反射和視覺功能[21]。

采用分子對接技術將艾柱燃燒產物活性成分與關鍵靶點JUN上游ERK1/2、p38 MAPK蛋白進行結合能力預測，發現麥芽酚、石竹素、叉明草素、豆甾醇與2種蛋白均具有良好的結合活性。同時，結合藍光誘導ARPE-19細胞損傷模型對具有結合活性的ERK1/2、p38 MAPK靶點進行驗證，發現艾柱燃燒產物組兩者蛋白表達均降低，表明艾柱燃燒產物能通過作用于JUN上游ERK1/2、p38 MAPK信號通路來拮抗視網膜損傷發生發展。此外，本研究基于前期實驗結果發現，雖然艾柱在燃燒后成分組成發生了很大變化，但其作用于視網膜損傷疾病的靶點卻與艾柱揮發油基本相同，表明通過網絡藥理學來研究中藥在燃燒或炮制過程中化學成分的變化及作用靶點的改變是有價值的，可更明確是哪些活性物質及靶點在疾病治療過程中起到核心作用。