基于網絡藥理學探討鐵皮石斛抗結直腸腫瘤的作用機制

張子函， 陳雨莎， 韋文娥， 張力圖， 劉海洲*

(1.廣西醫科大學，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院，廣西 南寧 530021)

結直腸癌是全球常見的惡性腫瘤之一，它在男性和女性中的發病率分別排第3位和第2位，大多數患者在確診時已處于晚期，早期癥狀不顯著[1]。基于鉑類和氟嘧啶的化療(例如奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶)已被用作結直腸癌新輔助化療和晚期結直腸癌化療的一線用藥，但是因耐藥而產生的治療失敗仍然不可避免，因此亟需尋找新的治療方法。鐵皮石斛是一種十分有價值的中藥，在我國已有近千年的使用歷史，多糖、菲類、芐類、黃酮等是從鐵皮石斛中分離的主要活性物質。研究認為，石斛中活性物質(毛蘭素、石斛酚、柚皮素等)[2-7]具有抗腫瘤、調節免疫、抗炎、降血脂等多種藥理活性[8]，對多種惡性腫瘤細胞具有一定的抑制作用，同時對結直腸癌有一定的預防作用[9]，但其機制尚不明確。本研究運用網絡藥理學方法，探討鐵皮石斛抗結直腸癌作用的主要活性成分及靶基因，以及相應的作用通路。

1 方法

1.1 鐵皮石斛有效成分和靶點篩選 在CNKI數據庫檢索關鍵詞“鐵皮石斛”和“成分”，經過篩選得到鐵皮石斛中的主要活性成分。在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中分別檢索鐵皮石斛中的主要活性化合物，得到它們的3D化學結構式，保存為“SDF”格式。將先前獲得的化合物SDF文件上傳至pharmmapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)預測鐵皮石斛中主要活性化合物的藥效團及其作用靶點。

1.2 鐵皮石斛中主要活性成分治療結直腸癌作用靶點的收集 在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)中以“colorectal cancer”作為檢索詞檢索結直腸癌作用的靶點，將鐵皮石斛主要活性化合物相關靶點與結直腸癌作用靶點用在線工具得到交集靶點并繪制韋恩圖。

1.3 PPI網絡構建 通過STRING(https://string-db.org/)數據庫分析蛋白相互作用，把先前獲取到的靶基因導入STRING數據庫中，并選擇物種為Homosapiens, 其余參數均為默認值，得到初步的蛋白相互作用網絡。在MCODE中找到最有意義的模塊，然后在Cytoscape中進行展示，并利用cytoHubba篩選得到樞紐基因。

1.4 GO功能、KEGG通路富集分析 通過DAVID數據庫對鐵皮石斛中3種主要成分的作用靶點進行基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析，使用R語言包ggpolt2繪制GO功能和KEGG通路的氣泡圖。

1.5 核心基因的數據庫驗證 利用TIMER數據庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)對獲得的核心基因進行驗證，得到它們在結直腸癌組織與正常組織之間的差異表達。并利用The Human Protein Atlas數據庫(https://www.proteinatlas.org/)得到核心基因的蛋白表達情況，觀察結直腸癌組織與正常腸組織之間的表達差異。

1.6 核心基因與主要化合物分子對接 利用分子對接技術探究鐵皮石斛主要成分與核心基因之間的相互作用。通過PubChem數據庫下載鐵皮石斛中主要成分的2D結構，利用ChemOffice將2D結構轉化為3D結構，之后在PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)中獲得蛋白三維結構，用PyMOL對蛋白結構加水并用AutoDockTools對其加氫并預測對接，并確定坐標相關參數，最后使用AutoDock Vina進行分子對接并獲得相應自由能。

2 結果

2.1 鐵皮石斛主要活性成分化學結構及靶點 通過CNKI數據庫進行檢索，時間為2020年12月10日，初檢得到597篇，篩選結果見表1，可知毛蘭素、石斛酚、柚皮素是鐵皮石斛主要成分。通過PubChem獲得毛蘭素、石斛酚、柚皮素結構式，見圖1，由Pharmmapper預測得到這3個化合物的藥效團和其作用靶點，見表2。

表1 鐵皮石斛主要活性成分的文獻檢索

注：A、B、C分別為毛蘭素、石斛酚、柚皮素2D結構，D、E、F分別為毛蘭素、石斛酚、柚皮素3D結構。圖1 毛蘭素、石斛酚、柚皮素結構

表2 鐵皮石斛主要活性成分的作用靶點(排名前10)

2.2 鐵皮石斛中主要活性成分治療結直腸癌的作用靶點 在GeneCards數據庫中檢索到9 329個與結直腸癌相關的基因，與鐵皮石斛中主要活性成分作用的141個潛在靶點取交集，得到94個交集靶點，見圖2。

圖2 結直腸癌靶基因和鐵皮石斛中主要活性成分靶基因的交集

2.3 PPI網絡 在STRING數據庫中上傳94個交集靶點，下載其數據和初步的蛋白互相作用網絡，該網絡由94個節點和175條邊組成。在Cytoscape中運用MCODE找到最有意義的模塊，如圖3A所示；利用cytoHubba篩選得到最有意義的10個樞紐基因，如圖3B所示(圓形節點為基因)，分別是HSP90AA1、ESR1、XPO1、AR、HCK、EIF4A1、CBL、RUVBL1、CCND1、GTF2B，這些靶基因最有可能是鐵皮石斛發揮抗結直腸癌作用時的作用靶點。

圖3 蛋白質相互作用及樞紐基因相互作用網絡圖

2.4 GO功能、KEGG通路富集分析 通過DAVID數據庫對鐵皮石斛中3種主要成分作用的靶基因進行GO功能、KEGG通路富集分析，獲得靶基因參與的信號通路和生物學過程，使用R軟件進行可視化，繪制氣泡圖，P值越小，說明富集的程度越高。GO功能富集分析結果顯示，細胞組分(CC)主要集中于細胞核和細胞質中(圖4)，分子功能(MF)主要集中于類固醇激素受體活性(Steroid hormone receptor activity)、核受體的活動(Nuclear receptor activity)、核受體結合(Nuclear receptor binding)等(圖5)，生物過程(BP)主要集中于類固醇激素反應(Response to steroid hormone)、前列腺上皮形態發生(Prostate gland epithelium morphogenesis)、前列腺形態發生(Prostate gland morphogenesis)、細胞對類固醇激素刺激的反應(Cellular response to steroid hormone stimulus)、類固醇激素介導的信號通路(Steroid hormone mediated signaling pathway)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄起始(Transcription initiation from RNA polymerase Ⅱ promoter)等(圖6)。KEGG通路富集分析結果顯示，谷胱甘肽代謝(Glutathione metabolism)、前列腺癌(Prostate cancer)、非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer)、PD-L1在癌癥中的表達及PD-1檢查點通路(PD-L1 expression and PD-1 checkpoint pathway in cancer)、癌癥中的蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、細胞衰老(Cellular senescence)、toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、慢性骨髓性白血病(Chronic myeloid leukemia)、病毒致癌作用(Viral carcinogenesis)、化學致癌作用(Chemical carcinogenesis)、Rap1信號通路(Rap1 signaling pathway)、胃癌(Gastric cancer)，甲狀腺癌(Thyroid cancer)、小細胞肺癌(Small cell lung cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)等32條通路與鐵皮石斛中主要活性成分的藥物作用通路相關(圖7)。由此可見，鐵皮石斛中主要活性化合物可作用于多種腫瘤通路對腫瘤產生影響，同時也能作用于多條不同的通路對結直腸癌產生抑制作用。

圖4 GO細胞組分富集分析

圖5 GO分子功能富集分析

圖6 GO生物過程富集分析

圖7 KEGG通路富集分析

2.5 核心基因的數據庫驗證 通過TIMER數據庫獲得核心基因的蛋白表達，比較正常組織與結直腸癌組織之間表達量，可以發現除了CBL以外，HSP90AA1、ESR1、XPO1、AR、HCK、EIF4A1、RUVBL1、CCND1、GTF2B表達在正常組織與結腸癌，正常組織與直腸癌之間均有顯著差異(圖8)。通過The Human Protein Atlas數據庫獲得核心基因的蛋白的免疫組化結果，XPO1、EIF4A1在結直腸癌組織中呈強陽性表達，而在正常結直腸組織中相對較弱；HCK在結直腸癌組織中呈中低表達，在正常組織中表達量很低甚至不表達；CBL、RUVBL1在結直腸癌組織和正常結直腸組織之間均有表達，但在腫瘤組織中的表達量相對較高(圖9)。

圖8 核心基因在正常結直腸組織與結直腸癌組織中的表達量

圖9 核心基因在正常結直腸組織、結直腸癌組織中的蛋白表達(免疫組化染色)

2.6 核心基因與主要化合物分子對接 分別針對PDB蛋白質數據庫搜索HSP90AA1、XPO1、ESR1、AR、HCK、RUVBL1、EIF4A1、CBL、CCND1、GTF2B，以獲得蛋白質的3D結構。表3顯示，3種核心化合物均與10種核心靶點具有相對緊密的結合。

3 討論

鐵皮石斛具有增強細胞免疫和體液免疫、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、抗菌等作用[10]，其活性成分毛蘭素是一類小分子聯芐類化合物，在結直腸中，可通過Toll樣受體4以及信號轉導和轉錄激活因子3信號傳導來發揮抗潰瘍性結腸炎活性[11]，具有一定的抗宮頸癌[12]、鼻咽癌[13]、乳腺癌[14]作用；柚皮素是一種黃烷酮，可通過抑制PI3K/Akt/NF-κB通路抑制卵巢癌細胞的增殖[15]，能有效抑制由N-亞硝基二乙胺引發的肝癌及癌前病變[16]，也被證實對小鼠皮膚腫瘤模型具有一定的抗腫瘤作用[17]；石斛酚也是一種聯芐類化合物，能通過調控NF-κB/PRL-3通路對骨肉瘤細胞的增殖起到抑制作用[18]，也是Wnt/β-catenin途徑的新型抑制劑，在乳腺癌細胞中表現出抗癌活性，對肝癌細胞增殖也具有一定的抑制作用[19]。目前暫無研究這3種主要活性成分之間的協同抗腫瘤作用及機制的報道。

本研究中分析發現鐵皮石斛主要活性成分作用于腫瘤相關通路中的核心基因，其中HSP90AA1基因可調節對腫瘤進展至關重要的幾種蛋白質的穩定性，并被確定為治療癌癥的有希望的靶標[20]，Vaseghi Maghvan等[21]通過生物信息學分析表明了HSP90AA1是包括結直腸癌在內的胃腸道腫瘤的關鍵基因；XPO1是調控細胞周期的基因，與結直腸癌的發病和增殖相關，有研究發現，與正常組織比較，XPO1在腫瘤組織中過表達，并與結直腸癌晚期分期顯著相關[22]；EIF4A1在細胞增殖和病毒復制的過程中起到重要作用，而EIF4A1在原發性結直腸癌組織中的表達也顯著上調[23]；Poh等[24]研究發現HCK水平與結直腸癌患者生存率降低有關，而小鼠體內HCK活性的增加也會促進內源性結腸惡性腫瘤與人結直腸癌細胞異種移植物的生長；在細胞中過表達的RUVBL1負調控p53表達，從而干擾p53介導的細胞凋亡，可以抑制結直腸腫瘤中凋亡細胞的死亡[25]；AR基因的聚谷氨酰胺(CAG)重復次數會影響結直腸癌的發病風險[26]，以上結果提示，鐵皮石斛對結直腸癌具有一定的治療作用，所預測的機制靶點也為后續研究提供了參考。

綜上所述，本研究借助網絡藥理學平臺, 通過對鐵皮石斛內3種活性物質治抗腫瘤作用的分子機制進行分析, 結合TIMER數據庫分析核心蛋白在結直腸癌中的表達和預后狀態，結果表明, 毛蘭素、石斛酚和柚皮素可協同作用結腸癌相關通路發揮抗結直腸癌作用。