半滑舌鰨白細胞介素12的p35a和p40c亞基在哈維氏弧菌感染下的表達和調控分析*

張志華 馮 博 朱騰飛 郝先才 王 倩 邵長偉 王洪巖

半滑舌鰨白細胞介素12的和亞基在哈維氏弧菌感染下的表達和調控分析*

張志華1,2馮 博1,2朱騰飛2郝先才2王 倩2邵長偉2王洪巖2①

(1. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 山東 青島 266071)

本研究以海水養殖魚類半滑舌鰨()為研究對象，克隆了白細胞介素12 (IL-12)的亞基和亞基的基因編碼區序列，編碼區長度分別為651 bp和984 bp。系統進化樹分析顯示，半滑舌鰨的和分別與其他魚類對應的基因聚為一支。氨基酸同源性分析顯示，與紅鰭東方鲀()相似性最高，與三棘刺魚()相似性最高，分別為52.04%和48.67%。組織表達分析顯示，在鰓、腦、心和卵巢中表達量較高，在肝、脾、鰓和心中表達量較高。通過哈維氏弧菌()感染實驗，分析了半滑舌鰨及其相關基因(和)在哈維氏弧菌感染過程中的表達模式，在脾中，48 h表達顯著上升(<0.05)，之后表達逐漸下降；在肝和腸中，72 h表達顯著上升。在脾、肝中，6 h表達顯著上升；在腎中，48 h產生上調；在腸中，6 h開始上調，并在48 h上升至最高點。在肝和腸中，均在表達上調之前顯著升高，在脾中晚于上調表達；在肝、脾、腎、腸中表達趨勢中均與的表達趨勢相反。將半滑舌鰨淋巴細胞過表達和基因后，檢測了受不同濃度脂多糖(LPS)刺激后干擾素()、腫瘤壞死因子(和)等免疫相關細胞因子的表達變化。結果顯示，能夠顯著提高在LPS刺激下的表達水平。上述結果表明，IL-12的亞基和亞基能夠響應哈維氏弧菌對半滑舌鰨的刺激，過表達能夠通過誘導基因的表達來參與機體的免疫應答。研究結果可為IL-12作為半滑舌鰨抗哈維氏弧菌疫苗佐劑的開發提供理論基礎。

半滑舌鰨；免疫應答；白細胞介素12；哈維氏弧菌

白細胞介素12 (interleukin 12，IL-12)是一種在先天性和適應性免疫應答中具有多效效應的細胞因子(Watford, 2003)。IL-12蛋白是由P35亞基和P40亞基通過二硫鍵共價連接形成的異源二聚體(Jones, 2011)，主要由抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells, APC)和吞噬細胞產生(Vignali, 2012)。Toll樣受體(toll-like receptor, TLR)識別病原相關分子模式介導IL-12的產生和釋放。在樹突狀細胞中，病原體通過結合TLR刺激樹突狀細胞產生初始的IL-12。而在巨噬細胞中，IL-12的產生必須有干擾素-γ (interferon-γ, IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)等輔助細胞因子的參與(Gee, 2009)。研究表明，P35亞基和P40亞基在同一細胞中表達，才能產生具有生物學活性的IL-12異源二聚體(Schoenhaut, 1992)。在缺乏P35亞基時P40亞基以單體或同二聚體的形式分泌，并與IL-12受體結合，從而抑制IL-12的活性。P35亞基不能單獨分泌到胞外，只能在與P40亞基結合后才能共同分泌，由于P35亞基的mRNA表達量較低，被認為是IL-12異源二聚體形成的限制因素(Gillessen, 1995)。前期研究表明，CD4+T細胞與APCs結合后，IL-12作為主要細胞因子，誘導CD4+T細胞向Th1細胞分化(Manetti, 1993)，而IL-10能夠抑制Th1細胞分化(Hsieh, 1993)。綜上所述，IL-12協調先天性免疫和適應性免疫，參與了宿主和病原體之間的相互作用，在清除細胞內病原體中具有重要作用(Prochazkova, 2012)。

半滑舌鰨是我國重要的海水養殖魚類(Song, 2016)，工廠化高密度養殖程度較高，以哈維氏弧菌()為主的細菌病在其養殖過程中造成了較高的死亡率，迫切需要開展免疫防控技術研究，提高半滑舌鰨對哈維氏弧菌病的抗病力。本課題組已完成半滑舌鰨全基因組測序(Chen, 2014)，前期利用全基因組選擇技術篩選出對哈維氏弧菌病抗病力高的親魚(Liu, 2018)；克隆與分析了、等多個與哈維氏弧菌病相關的免疫基因(Li, 2020; Wang, 2019; Wei, 2018a、2018b、2019)。本研究克隆半滑舌鰨和的編碼序列，并分析、及相關免疫基因(和)在半滑舌鰨哈維氏弧菌感染過程中的表達模式。同時，利用半滑舌鰨淋巴細胞過表達和，并進行LPS刺激，探究半滑舌鰨IL-12參與免疫應答的可能調控途徑，以期為研制半滑舌鰨哈維氏弧菌病的疫苗佐劑奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

本實驗所用半滑舌鰨均來自明波水產養殖公司(山東萊州)。隨機取3條健康的半滑舌鰨成魚，麻醉后分別取胃、腸、脾臟、肝臟、心臟、腎臟、性腺、鰓、腦和肌肉，分裝至凍存管后迅速在液氮中冷凍，取出后，保存于–80℃超低溫冰箱。哈維氏弧菌感染實驗使用40條健康半滑舌鰨，體長為(41.0±2.7) cm，體重為(438.4±53.0) g，具體實驗方案參照之前操作步驟(Wei, 2018b)，腹腔注射的哈維氏弧菌濃度為1×104CFU/mL，注射劑量為4 μL/g。分別在注射后的6、16、48、72和96 h進行樣品采集，每個時間點分別隨機選取5條魚，將魚麻醉，采集肝臟、腎臟、脾臟、腸4個免疫相關組織，采集的樣品用錫紙包裹后迅速放入液氮中，之后保存于–80℃超低溫冰箱。

1.2 RNA提取及cDNA合成

采用Trizol法提取半滑舌鰨各組織中的RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，之后使用極微量分光光度計檢測RNA的濃度與純度，從而獲得符合實驗要求的RNA。使用cDNA反轉錄試劑盒(TaKaRa)，按照說明書進行cDNA的合成。

1.3 p35a和p40c基因編碼區全長cDNA的克隆

根據已發表的半滑舌鰨全基因組序列獲得和的預測序列，根據序列使用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)，以免疫組織的cDNA為模板進行PCR擴增驗證編碼區序列，PCR反應體系：La酶(TaKaRa) 0.5 μL，dNTP 8 μL，10×buffer 5 μL，滅菌去離子水33.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL；反應程序：94℃ 1 min，36個循環(98℃ 12 s，65℃ 30s，72℃ 2 min)，72℃ 10 min。之后對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，切下單一條帶的PCR產物，使用膠回收試劑盒(Vazyme)進行回收純化，將純化后的PCR產物連接到pEASY-T1 (TIANGEN)載體，按照說明書進行后續基因克隆實驗，最后挑取陽性克隆交由華大基因科技有限公司進行測序。

1.4 生物學分析及進化樹構建

測序后的結果使用DNAMAN和SnapGene進行比對和分析，得到所克隆的半滑舌鰨的和的編碼序列，根據編碼區序列使用ExPASy (http://web. expasy.org/compute_pi/)預測蛋白分子量及等電點；利用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)預測蛋白質結構域；使用PyMOL預測IL-12的蛋白質三維結構模型；多序列比對和進化樹構建所需的氨基酸序列均來源于Ensemble和NCBI數據庫；通過MEGA 7.0，使用鄰接法(neighbor joining, NJ)構建系統進化樹(bootstrap＝1000)。

1.5 p35a和p40c及相關基因表達模式檢測

選取各組織中1 μg的RNA，利用Prime Script RT reagent試劑盒(TaKaRa, 日本)反轉錄生成cDNA。通過-qF/R和-qF/R引物(表1)，利用Quantinova SYBR Green PCR試劑盒(QiaQen)進行RT-qPCR，反應體系為20 μL，分別包含1 μL cDNA、10 μL SYBR Green PCR Master Mix (2×)、2 μL ROX Reference Dye、0.7 μmol/L的上游和下游引物以及5.6μL無菌水。反應在ABI StepOnePlus_Real-Time PCR System (Applied Biosystems, 美國)上進行，反應程序：95℃2 min；95℃ 5 s, 60℃ 10 s，共40個循環；95℃ 15 s, 60℃ 1 min, +1℃/min, 95℃ 15 s。使用-作為內參(-qF/R) (表1)。每個反應體系重復3次。使用2–ΔΔCt方法分析、及其相關基因在半滑舌鰨各組織、哈維氏弧菌感染的免疫組織及細胞樣品中的表達水平。使用SPSS軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，設定<0.05為差異顯著。

表1 實驗所用的引物

Tab.1 Primers used in the experiments

1.6 半滑舌鰨p35a和p40c過表達載體的構建

使用ClonExpress Ⅱ One Step cloning kit-C112 (Vazyme)對pHAGE載體和、的編碼區序列分別進行重組，得到pHAGE-和pHAGE-重組載體。將重組后的產物轉入感受態細胞中，挑選單克隆進行PCR鑒定。對鑒定出的陽性菌落進行測序，以確保載體構建的準確性。篩選準確的單細胞克隆菌株進行培養，使用EndoFree mini plasmid kit Ⅱ(TIANGEN)，獲得半滑舌鰨的和過表達載體。

1.7 半滑舌鰨原代細胞培養、轉染與LPS處理

將健康的半滑舌鰨放于18℃～20℃高雙抗消毒海水(1000 μg/mL鏈霉素，1000 IU/mL青霉素)中暫養12～24 h后，在實驗前將魚放入75%酒精中浸泡1～2 min，于超凈工作臺中，用注射器抽取半滑舌鰨血液，使用含有抗凝劑的PBS重懸細胞，過40 μm細胞篩，再用PBS漂洗3遍，收集沉淀。之后，用5% FBS-DMEM/ F12培養液充分懸浮并均勻接種于T25培養瓶中，進行細胞計數，調整細胞密度至約2×106個/mL，在24℃培養箱中啟動原代培養。24 h后，將細胞所用培養液更換為DMEM/F12，分別添加10%胎牛血清(FBS)、100 μg/mL鏈霉素、100 IU/mL青霉素、40 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF和40 ng/mL IGF-I。使用Lipo2000 (Invitrogen)進行細胞轉染，每孔添加2.5 μg質粒(對照組添加空質粒)，按說明書進行后續操作。分別用不同濃度的LPS (0、1、10 mg/L)進行處理，在24 h收集細胞置于–80℃冰箱中，留待后續檢測。

2 結果與分析

2.1 p35a和p40c基因編碼區克隆、序列分析和蛋白質三維結構模型預測

完成了半滑舌鰨和基因編碼區序列的克隆，其中，的ORF為651 bp，編碼216個氨基酸，預測蛋白質的分子量為24.11 kDa，理論等電點(pI)為7.49 (圖1)；的ORF為984 bp，編碼327個氨基酸，預測蛋白質的分子量為37.78 kDa，pI為6.57(圖2)。將和的cDNA比對基因組DNA，顯示和都包含7個外顯子。

通過SMART進行保守結構分析。結果顯示，P35a蛋白中存在1個IL-12蛋白結構域；P40c存在3個蛋白結構域，分別為免疫球蛋白結構域(IG)、IL-12p40_c結構域和Ⅰ類細胞因子受體結構域(d1f42a3)。其中，P40c還具有1個信號肽(圖3)。使用PyMOL同源建模半滑舌鰨P35a和P40c的蛋白質三級結構，結果顯示，半滑舌鰨的P35a蛋白含有較多的α-螺旋，為P35典型四螺旋拓撲結構；半滑舌鰨P40c蛋白則含有較多的β折疊；P35a蛋白和P40c蛋白以類似于配體和受體結合的方式，共價結合形成異源二聚體(圖4)。

圖1 半滑舌鰨p35a基因核苷酸序列及推測的氨基酸序列

方框內為起始密碼子、終止密碼子。圖2同

The box contains start codon and stop codon. The same as in Fig.2

圖2 半滑舌鰨p40c基因核苷酸序列及推測的氨基酸序列

圖3 半滑舌鰨p35a和p40c的基因結構示意圖及蛋白質結構域預測

圖4 P35a、P40c和IL-12蛋白質的三維結構預測

A: P35a; B: P40c; C: IL-12

2.2 系統進化樹和多序列比對分析

系統進化樹結果顯示，P35與P40均聚為4支，其中，P35分為魚的P35a、P35b，鳥類的P35和哺乳動物的P35 (圖5A)，P40分別為魚類的P40a、P40b，P40c以及鳥類和哺乳動物的P40 (圖5B)。半滑舌鰨的P35和P40分別與魚類的P35a和P40c聚為一支，說明它們在進化關系上更為接近。

半滑舌鰨P35a和P40c蛋白序列與其他物種蛋白序列的比對分析結果見表2 (所用物種氨基酸序列同系統進化樹所用氨基酸序列一致)。P35a蛋白與紅鰭東方鲀的P35a蛋白相似性最高，為52.04%。P40c蛋白與三棘刺魚()的P40c蛋白的序列相似性最高，為48.67%。

2.3 組織表達模式

和在半滑舌鰨不同組織的表達顯示，基因在鰓、心、腦和卵巢等組織表達水平較高，在其他組織中也有一定程度表達；基因在肝中表達水平最高，在脾和鰓中有較高表達，在心臟、精巢和胃中也有一定程度的表達，而在腎和肌肉中幾乎不表達(圖6)。

2.4 p35a和p40c在哈維氏弧菌感染實驗中的表達分析

哈維氏弧菌感染后，和在脾、肝、腎和腸中均有顯著性表達差異。在脾臟和肝臟中的表達模式相似。在脾中，在6 h顯著升高，之后表達逐漸降低；在48 h顯著升高，之后表達逐漸降低。在肝中，同樣在6 h顯著升高；但在72 h才顯著升高。在腎和腸中，和則呈現出與之不同的表達模式。在腸中，率先在6 h上調，之后持續上調到48 h表達最高，維持高表達到72 h，之后在96 h與一起下調。在6 h升高，中間表達量降低，于48 h表達最高，之后表達量逐漸下降；在48 h顯著升高，之后逐漸降低(圖7)。

2.5 IL-12相關基因(ifn-γ、il-10)在哈維氏弧菌感染實驗中的表達分析

哈維氏弧菌注射后，在脾臟和腸道中的表達模式相似，表達在6 h開始升高，在16 h達到最高，之后表達逐漸下降。在脾中，16 h表達開始上調，在開始下降后的第48小時達到最高，之后表達逐漸下降；在腸中差異情況較小。和在腎臟和肝臟中的表達模式相似，和均在6 h顯著上調，之后在脾中表達逐漸降低；會在肝中的16 h維持一定的高表達，直到48 h才和一起逐漸下降(圖8)。

2.6 半滑舌鰨相關基因在淋巴細胞中過表達pHAGE- p35a和pHAGE-p40c后的表達模式

轉染空載體的對照組和基因表達量較低，且在不同濃度的LPS刺激后，表達量沒有顯著差異。轉染pHAGE-p35a和pHAGE-p40c載體的實驗組，和基因表達量顯著高于對照組 (圖9)。

圖5 P35a (A)和P40c (B)系統發育樹

氨基酸序列號：

P35a：綠河鲀(H3C7F9)；紅鰭東方鲀(H2SI85)；青鳉(XP_004075675.1)；三棘刺魚(G3P753); 劍尾魚(XP_023207637.1)；羅非魚(I3J6P0)

P35b：綠河鲀(Q6UAL9)；青鳉(XP_004079386.2)；三棘刺魚(G3PKZ2)；劍尾魚(XP_023190996.1)。

P35：鴨(U3IER1)；火雞(G1NDR2)；小鼠(P43431)；馬(Q9XSQ6)；人(P29459)；豬(Q29053)；牛(P54349)。

P40c：青鳉(H2L9T4)；羅非魚(I3KA75)；三棘刺魚(G3NJZ0)；庸鰈(D0QTF8)。

P40b：斑馬魚(A8WH95)；鯉魚(Q2PCT1)；三棘刺魚(G3QAY2)；青鳉(H2LA74)；羅非魚(I3JPN9)。

P40a：斑馬魚(Q6F3Q9)；鯉魚(Q2PD23)；青鳉(H2LTF6)；羅非魚(I3KMB3)；海鱸魚(Q1KX13)；三棘刺魚(G3Q3E4)。

P40：雞(Q6X0K9)；鼠(P43432)；人(P29460)；牛(P46282)

Amino acid sequence number:

P35a:(H3C7F9);(H2SI85);(XP_004075675.1);(G3P753);(XP_023207637.1);(I3J6P0).

P35b:(Q6UAL9);(XP_004079386.2);(G3PKZ2);(XP_023190996.1).

P35:(U3IER1);(G1NDR2);(P43431);(Q9XSQ6);(P29459);(Q29053);(P54349).

P40c:(H2L9T4);(I3KA75);(G3NJZ0);(D0QTF8).

P40b:(A8WH95);(Q2PCT1);(G3QAY2);(H2LA74);(I3JPN9).

P40a:(Q6F3Q9);(Q2PD23);(H2LTF6);(I3KMB3);(Q1KX13);(G3Q3E4).

P40:(Q6X0K9);(P43432);(P29460);(P46282)

表2 半滑舌鰨P35a和P40c蛋白序列與其他物種蛋白序列的相似性

Tab.2 Similarity of P35a and P40C protein sequences between C. semilaevis and other species

對照組表達量在不同濃度的LPS刺激下，隨著LPS濃度的增加，表達量呈上升趨勢。實驗組在轉染的過表達載體后，的表達量上升幅度顯著高于對照組。、和基因的表達量在對照組和實驗組中均沒有顯著變化(圖10)。

3 討論

本研究獲得了半滑舌鰨亞基和亞基基因的編碼序列，進化樹分析表明它們分別屬于魚類和亞型。結構域預測顯示，和基因都含有典型的IL-12家族結構域，且都不含跨膜結構域還含有亞基都具有的免疫球蛋白結構域(IG)和Ⅰ類細胞因子受體結構域(d1f42a3)。前期研究報道，與具有相似結構域的造血細胞因子受體家族成員IL-6受體()，可以通過蛋白質水解或選擇性剪接的方式以可溶性形式(缺乏跨膜結構域)從細胞中釋放，然后可溶性IL-6R和IL-6在溶液中結合成復合物，介導下游信號通路的調控(Collison, 2012; Vignali, 2012)。因此，可以把IL-12理解成細胞因子與可溶性細胞因子受體共價結合形成的復合物。組織表達結果顯示，主要在鰓、腦、心和卵巢中具有較高表達，主要在肝、鰓、心臟和精巢中有較高表達。均在鰓中高表達，可能是因為鰓是病原體首先侵入魚體的器官。

本研究分析了半滑舌鰨和在哈維氏弧菌感染后的時空表達特征。免疫器官中的和及相關基因(和)存在時空表達差異性。在脾和肝中，和不在同一時間高表達，但亞基也不會以單體形式存在于細胞中(D'Andrea, 1992)。目前，已在草魚()、大西洋鮭()等硬骨魚中發現了亞基和亞基的多個亞型(Pandit, 2015; Wang, 2014b)，表明半滑舌鰨中可能還具有亞基的其他亞型。亞基的同源二聚體可以通過結合IL-12受體來抑制IL-12的產生(Heinzel, 1997)，但結合在脾和肝中的表達模式，亞基更可能是與亞基的其他亞型形成IL-12在免疫器官中發揮調控作用。因此，推測在半滑舌鰨中存在多個亞基和亞基的亞型。在腸中，和的表達趨勢一致，表明半滑舌鰨IL-12的/亞型在應對哈維氏弧菌感染時可能在腸中發揮相應作用。而在腎中，由于表達量變化不明顯以及其組織表達量低，還需要進一步探究和在腎臟中是否響應哈維氏弧菌感染。上述結果表明，IL-12的不同亞型可能在不同的免疫器官中發揮不同的免疫功能。

圖6 p35a(A)和p40c(B)基因在半滑舌鰨中的組織表達模式

數據用3個獨立個體的平均值±標準誤表示(=3)。不同字母間表示差異顯著(<0.05)

Data were the Mean±SE of three independent individuals (=3). Different letters represent significant difference (<0.05)

圖7 p35a和p40c mRNA在哈維氏弧菌感染后的半滑舌鰨免疫組織中的表達模式

字母的大小寫標注僅用來區分不同基因間的顯著性，不同字母間表示差異顯著(<0.05)。下同

The case labeling of letters is only used to distinguish the significance between different genes, and the difference with different letters was significant (<0.05). The same as below

圖8 ifn-γ和il-10在哈維氏弧菌感染后的半滑舌鰨免疫組織中的表達模式

圖9 細胞過表達實驗中p35a和p40c基因的表達模式

對照組(C)：轉染空載體；實驗組(P)：和共轉，均用0、1、10 ng/L的LPS進行刺激。組別命名為C0、C1、C10、P0、P1和P10。下同

Control group (C): Transfected with empty vector; Experimental group (P): Co-transfected withand. Stimulated with 0, 1, 10 ng/L LPS. The groups were named as C0, C1, C10, P0, P1, and P10. The same as below

在哈維氏弧菌感染實驗中，還檢測了和在半滑舌鰨不同免疫組織中的表達模式。在脾中，呈現出典型的IL-12調控模式(Wang, 2014a)，在6 h升高后，與其他亞型的亞基產生IL-12，從而誘導在16 h顯著升高；在48 h急劇升高，抑制IL-12的產生，從而使和在48 h之后的表達逐漸降低。在腸中，在IL-12表達升高前高表達，之后下降，并沒有因表達量升高而維持在一個較高水平，這暗示在腸中可能主要發揮激活IL-12細胞因子產生的功能(Zhang, 2008)。而作為Th2免疫應答的主要細胞因子，其表達均在IL-12高表達后被抑制，表達模式和發揮的功能較為單一，這可能是由于Th0細胞向Th1細胞或Th2細胞的分化途徑相對較為保守(Collison, 2012)。作為與IL-12相關的細胞因子，發揮功能呈現出時空多樣性，側面佐證了IL-12可能在不同器官中對相關的免疫應答具有差異調控作用，這表明IL-12的調控方式可能較為復雜。到目前為止，IL-12受體在魚類中還未確定，哺乳動物的IL-12受體由亞基1和亞基2構成。由于魚類基因組復制事件，免疫基因(細胞因子和細胞因子受體)通常以2個拷貝的形式存在(Husain, 2012)。IL-12配體和受體亞單位的多樣性組合，進一步證明魚類IL-12調控系統的復雜性。因此，IL-12細胞因子在魚類中通過多種同源基因的擴增，共享配體和受體中的亞基，可能組成了一個極其復雜的內部調節網絡來微調它們的免疫反應。

在LPS刺激半滑舌鰨淋巴細胞實驗中，的表達量響應了LPS刺激，和表達量變化對LPS刺激的響應不顯著?？赡芤驗?亞型不是體外培養的淋巴細胞中主要響應LPS的免疫蛋白。在之前的研究中，虹鱒不同亞型的IL-12分別針對不同的刺激源(病毒、細菌和寄生蟲)展現出不同的表達模式。其中，/c亞型針對病毒和寄生蟲感染，表達明顯上調，而針對細菌感染，表達上調不顯著(Wang, 2014b)。在過表達和后，實驗組的表達量響應LPS刺激的上升幅度明顯高于對照組，表明IL-12的/亞型能夠通過誘導基因的表達，參與半滑舌鰨淋巴細胞響應LPS刺激，提升機體的免疫應答水平。

圖10 LPS刺激半滑舌鰨過表達p35a和p40c淋巴細胞的相關基因表達模式

綜上所述，IL-12是半滑舌鰨響應哈維氏弧菌病，參與免疫調控并提升免疫應答水平的重要細胞因子。因此，可以使用重組的IL-12作為半滑舌鰨的哈維氏弧菌疫苗的佐劑之一，但由于半滑舌鰨IL-12參與的免疫應答非常復雜，需進一步研究半滑舌鰨IL-12的所有組成亞基，探究不同組成的IL-12的結構特征和免疫調控模式，從而提高半滑舌鰨的IL-12作為疫苗佐劑所增強的免疫效果。

ARTS J, TIJHAAR E, CHADZINSKA M,. Functional analysis of carp interferon-g: Evolutionary conservation of classical phagocyte activation. Fish and Shellfish Immunology, 2010, 29(5): 793–802

CHEN S, ZHANG G, SHAO C,. Whole-genome sequence of a flatfish provides insights into ZW sex chromosome evolution and adaptation to a benthic lifestyle. Nature Genetics, 2014, 46(3): 253–260

COLLISON L W, DELGOFFE G M, GUY C S,. The composition and signaling of the IL-35 receptor are unconventional. Nature Immunology, 2012, 13(3): 290–299

D'ANDREA A, RENGARAJU M, VALIANTE N M,. Production of natural killer cell stimulatory factor (interleukin 12) by peripheral blood mononuclear cells. Journal of Experimental Medicine, 1992, 176(5): 1387–1398

GEE K, GUZZO C, CHE MAT N F,. The IL-12 family of cytokines in infection, inflammation and autoimmune disorders. Inflamm Allergy Drug Targets, 2009, 8(1): 40–52

GILLESSEN S, CARVAJAL D, LING P,. Mouse interleukin-12 (IL-12) p40 homodimer: A potent IL-12 antagonist. European Journal of Immunology, 1995, 25(1): 200–206

HEINZEL F P, HUJER A M, AHMED F N,. In vivo production and function of IL-12 p40 homodimers. Journal of Immunology, 1997, 158(9): 4381–4388

HSIEH C S, MACATONIA S E, TRIPP C S,. Development of TH1 CD4+T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science, 1993, 260(5107): 547–549

HUISING M O, VAN SCHIJNDEL J E, KRUISWIJK C P,. The presence of multiple and differentially regulated interleukin-12p40 genes in bony fishes signifies an expansion of the vertebrate heterodimeric cytokine family. Molecular Immunology, 2006, 43(10): 1519–1533

HUSAIN M, BIRD S, VAN ZWIETEN R,. Cloning of the IL-1b3 gene and IL-1b4 pseudogene in salmonids uncovers a second type of IL-1b gene in teleost fish. Developmental and Comparative Immunology, 2012, 38(3): 431–446

JONES L L, VIGNALI D A. Molecular interactions within the IL-6/IL-12 cytokine/receptor superfamily. Immunologic Research, 2011, 51(1): 5–14

KOBAYASHI M, FITZ L, RYAN M,. Identification and purification of natural killer cell stimulatory factor (NKSF), acytokine with multiple biologic effects on human lymphocytes. Journal of Experimental Medicine, 1989, 170(3): 827–845

LI K M, XU W T, FU X Q,Gene cloning and immune response analysis of protein kinase C-alpha (PKC α) in. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(2): 69–77 [李坤明, 徐文騰, 扶曉琴, 等. 半滑舌鰨蛋白激酶C-alpha (PKCα)的基因克隆和免疫應答分析. 漁業科學進展, 2020, 41(2): 69–77]

LIU Y, XU W, ZHANG B,. QTL Detection for albinism-related loci in Chinese tongue sole (). Journal of Ocean University of China, 2018, 17: 1404–1410

MANETTI R, PARRONCHI P, GIUDIZI M G,. Natural killer cell stimulatory factor (interleukin 12 [IL-12]) induces T helper type 1 (Th1)-specific immune responses and inhibits the development of IL-4-producing Th cells. Journal of Experimental Medicine, 1993, 177(4): 1199–1204

MATSUMOTO M, ARAKI K, HAYASHI K,. Adjuvant effect of recombinant interleukin-12 in the Nocardiosis formalin-killed vaccine of the amberjack. Fish and Shellfish Immunology, 2017, 67: 263–269

NASCIMENTO D S, DO VALE A, TOMáS A M,. Cloning, promoter analysis and expression in response to bacterial exposure of sea bass (L.) interleukin-12 p40 and p35 subunits. Molecular Immunology, 2007, 44(9): 2277–2291

?VERG?RD A C, NEPSTAD I, NERLAND A H,. Characterisation and expression analysis of the Atlantic halibut (L.) cytokines: IL-1b, IL-6, IL-11, IL-12b and IFNg. Molecular Biology Reports, 2012, 39(3): 2201–2213

PANDIT N P, SHEN Y B, XU X Y,Differential expression of interleukin-12 p35 and p40 subunits in response to Aeromonas hydrophilp and Aquareovirus infection in grass caro,. Genetics and Molecular Research, 2015, 14(1): 1169–1183

PROCHAZKOVA J, POKORNA K, HOLAN V. IL-12 inhibits the TGF-b-dependent T cell developmental programs and skews the TGF-b-induced differentiation into a Th1-like direction. Immunobiology, 2012, 217(1): 74–82

SCHOENHAUT D S, CHUA A, WOLITZKY A,. Cloning and expression of murine IL-12. Journal of Immunology, 1992, 148(11): 3433–3440

SONG W T. Breeding and research progress ofin China. Journal of Science, Technology and Economics, 2016(20): 95 [宋文濤. 我國半滑舌鰨養殖及研究進展. 科技經濟導刊, 2016(20): 95]

TSAI J L, JOSE PRIYA T A, HU K Y,. Grouper interleukin-12, linked by an ancient disulfide-bond architecture, exhibits cytokine and chemokine activities. Fish and Shellfish Immunology, 2014, 36(1): 27–37

VIGNALI D A, KUCHROO V K. IL-12 family cytokines: Immunological playmakers. Nature Immunology, 2012, 13(8): 722–728

WANG S Y, WANG L, CHEN Z F,Cloning and expression analysis of polyglobulin receptor (pIgR) gene in. Progress in Fishery Sciences, 2019, 40(2): 51–57 [王雙艷, 王磊, 陳張帆, 等. 半滑舌鰨多聚免疫球蛋白受體(pIgR)基因的克隆和表達分析. 漁業科學進展, 2019, 40(2): 51–57]

WANG T, HUSAIN M, HONG S,. Differential expression, modulation and bioactivity of distinct fish IL-12 isoforms: Implication towards the evolution of Th1-like immune responses. European Journal of Immunology, 2014b, 44(5): 1541–1551

WANG T, HUSAIN M. The expanding repertoire of the IL-12 cytokine family in teleost fish: Identification of three paralogues each of the p35 and p40 genes in salmonids, and comparative analysis of their expression and modulation in Atlantic salmon. Developmental and Comparative Immunology, 2014a, 46(2): 194–207

WATFORD W T, MORIGUCHI M, MORINOBU A,. The biology of IL-12: Coordinating innate and adaptive immune responses. Cytokine and Growth Factor Reviews, 2003, 14(5): 361–368

WEI M, XU W T, GAN T,. Cloning, expression prolife, and immune characterization of a novel stat family member (stat5bl) in Chinese tongue sole (). Fish and Shellfish Immunology, 2019, 84: 962–969

WEI M, XU W T, LI H L,. Molecular characterization and expression analysis of a novel r-spondin member (rspo2l) in Chinese tongue sole (). Fish and Shellfish Immunology, 2018b, 72: 436–442

WEI M, XU W T, LI K M,. Cloning, characterization and functional analysis of dctn5 in immune response of Chinese tongue sole (). Fish and Shellfish Immunology, 2018a, 77: 392–401

YOSHIURA Y, KIRYU I, FUJIWARA A,. Identification and characterization of Fugu orthologues of mammalian interleukin-12 subunits. Immunogenetics, 2003, 55(5): 296–306

ZHANG S, WANG Q. Factors determining the formation and release of bioactive IL-12: Regulatory mechanisms for IL-12p70 synthesis and inhibition. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, 372(4): 509–512

Expression and Regulation Analysis of theandSubunits of Interleukin 12 inInfected by

ZHANG Zhihua1,2, FENG Bo1,2, ZHU Tengfei2, HAO Xiancai2, WANG Qian2, SHAO Changwei2, WANG Hongyan2①

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao, Shandong 266071, China)

Interleukin 12 (IL-12), a key molecular switch in the immune response, is a pleiotropic cytokine composed of theandsubunits. It has been proven that IL-12 can be used as a vaccine adjuvant to enhance the immune response level of fish, and is used in the development of vaccines against pathogen infection. In this study, we cloned the coding regions of thesubunit andsubunit of IL-12 in Chinese tongue sole (), with a length of 651 bp and 984 bp, respectively. The phylogenetic analysis showed that theandofwere clustered with the corresponding genes in other fishes. The sequence of amino acid homology analysis showed thatandofhad the highest similarity with52.04%)48.67%tissue expression analysis showed thatwas highly expressed in the gill, brain, heart, and ovary, andwas highly expressed in the liver, spleen, gill, and heart. We further analyzed the expression patterns of,, and their related genes (-and-) after infection with Vibrio harveyi. The expression ofincreased significantly at 48 h (<0.05), and then gradually decreased in the spleen, and its expression increased significantly at 72 h in the liver and intestine. The expression ofincreased significantly at 6 h in spleen and liver, and at 48 h in kidney. Its expression also began to increase at 6 h and peaked at 48 h in the intestine. The expression ofincreased significantly before the upregulated expression ofin the liver and intestine, and later thanin the spleen. The expression ofwas opposite to that ofin the liver, spleen, kidney, and intestine. The expression of the immune related cytokines (-,-,-,and-) in the lymphocytes ofwas detected after the overexpression of theandgenes. The results showed thatandcould significantly increase the expression of-under lipopolysaccharide stimulation. The results indicate that theandsubunits of IL-12 respond to stimulation by V.harveyi in, and then participate in the immune response by inducing the expression of the-gene, which provides a theoretical basis for the development of IL-12 as an adjuvant for thevaccine against V. harveyi.

; Immune response; Interleukin 12;

S941.42+4

A

2095-9869(2022)03-0012-12

10.19663/j.issn2095-9869.20210303001

http://www.yykxjz.cn/

張志華, 馮博, 朱騰飛, 郝先才, 王倩, 邵長偉, 王洪巖. 半滑舌鰨白細胞介素12的和亞基在哈維氏弧菌感染下的表達和調控分析. 漁業科學進展, 2022, 43(3): 12–23

ZHANG Z H, FENG B, ZHU T F, HAO X C, WANG Q, SHAO C W, WANG H Y. Expression and regulation analysis of theandsubunits of interleukin 12 ininfected by. Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(3): 12–23

WANG Hongyan, E-mail: wanghongyan@ysfri.ac.cn

* 國家重點研發計劃項目(2018YFD0900301)、中國水產科學研究院創新團隊項目(2020TD19)和財政部和農業農村部：國家現代農業產業技術體系共同資助[This work was supported by the National Key Research and Development Program of China (2018YFD0900301), Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2020TD19), and China Agriculture Research System of MOF and MARA]. 張志華，E-mail: zhangzh0115@163.com

王洪巖，E-mail: wanghongyan@ysfri.ac.cn

2021-03-03,

2021-03-22

(編輯 馮小花)