中國對蝦ATG5基因的克隆及其在pH、碳酸鹽堿度脅迫下的表達分析*

魏 威 何玉英 李朝霞 周雨欣 李 健 謝擁軍

中國對蝦基因的克隆及其在pH、碳酸鹽堿度脅迫下的表達分析*

魏 威1,2何玉英2李朝霞1①周雨欣3李 健2謝擁軍4

(1. 青島農業大學海洋科學與工程學院 山東 青島 266237；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 山東 青島 266071；3. 水產科學國家級實驗教學示范中心 上海海洋大學 上海 201306; 4. 河北省水產良種與漁業環境監測保護總站 河北 石家莊 050011)

采用cDNA末端快速擴增(RACE)技術獲得中國對蝦()基因cDNA全長，命名為。利用實時熒光定量技術分析了的組織表達及其在pH和碳酸鹽堿度脅迫下的表達特征，并利用RNAi技術驗證其功能。基因分析顯示，cDNA全長為2225 bp，開放閱讀框為810 bp，編碼269個氨基酸，預測其編碼的蛋白質分子量為31.103 kDa，理論等電點為5.59，為疏水性蛋白，包含1個APG5自噬相關蛋白結構域，無跨膜結構，不包含信號肽。同源性和系統進化分析顯示，具有高度保守性，與凡納濱對蝦()同源性最高(98.14%)。組織表達分析顯示，在中國對蝦各組織中均有表達，肌肉中表達量最高(<0.05)，血淋巴細胞中最低(<0.05)。pH脅迫后48 h在鰓中的表達量最低，為對照組的1.68倍；脅迫后96 h最高，為對照組的2.67倍。碳酸鹽堿度脅迫后12 h，在鰓中表達量最高，為對照組的2.77倍；脅迫后96 h最低，為對照組的1.30倍。干擾實驗結果顯示，pH和碳酸鹽堿度脅迫下，沉默基因會使中國對蝦死亡率顯著增高(<0.05)，表明該基因的表達量越高，越有利于中國對蝦存活。實時定量結果表明，在pH、碳酸鹽脅迫下的表達量均顯著升高(<0.05)，推測自噬可能參與中國對蝦應對非生物脅迫的調控。本研究結果對水生動物特別是甲殼動物中細胞自噬研究具有重要的借鑒意義，有助于推進中國對蝦鹽堿水養殖的研究進程。

中國對蝦；；pH脅迫；碳酸鹽堿度脅迫；RNAi

我國鹽堿水的面積高達4.6×107hm2(陳學洲等, 2020)，高pH和高堿度是鹽堿水最明顯的2個特征。調查顯示，山東東營鹽堿水pH為8.5～9.5，碳酸鹽堿度為1.4～8.0；河北滄州鹽堿水pH為8.3～9.2，碳酸鹽堿度為3.5～13.0 (Ge, 2019)。資源豐富的鹽堿水既不能用于人畜飲用，也不能用于農田灌溉。因此，鹽堿水養殖是鹽堿水開發利用的有效途徑。pH值是養殖水體的重要指標，水體pH發生變化會引起刺參(Nakai)、海灣扇貝()的應激反應，嚴重影響其生長發育，甚至導致水生動物死亡(韓莎等, 2018; Liu, 2020)。鹽堿水的pH值遠高于正常養殖水體(pH為7.5～8.5) (韓旭等, 2021)，在養殖過程中產生的殘餌和廢料也會使水體富營養化，從而導致養殖水體pH值升高(Lucia, 2013; 李瑞萍等, 2015)。過高的pH會腐蝕蝦的鰓組織，使其呼吸困難，嚴重時可導致窒息死亡，同時會使免疫功能下降，直接或間接影響其生長、繁殖和抗氧化等能力(胡碩等, 2019; 趙先銀等, 2011;王蕓等, 2013)。水體堿度一般是指水體中能與強酸發生中和反應的物質總量，主要由HCO3–、CO32–組成，稱為碳酸鹽堿度(柳飛等, 2016)。房文紅等(2000)研究表明，水體堿度與pH影響中國對蝦()幼蝦的存活率，高碳酸鹽堿度會影響中國對蝦的生長、發育和繁殖。脊尾白蝦()的抱卵率、孵化率和幼體成活率等會隨著堿度的升高而降低(么宗利等, 2010、2012; 柳飛等, 2016)。上述研究表明，鹽堿水的高pH和高堿度特性是影響水生生物生長存活的主要原因。近年來，凡納濱對蝦()、脊尾白蝦、羅非魚()等經過多年鹽堿水養殖模式和技術的探索，已基本實現鹽堿水養殖，大大提高了鹽堿水的利用率，創造了較大的經濟價值(孫家強, 2018; 馮偉業等, 2020)。因此，研究中國對蝦的耐鹽堿機制，為提升其對環境的適應性及抗逆性提供理論依據，對早日實現中國對蝦鹽堿水養殖具有重要意義。

自噬(autophagy)是細胞維持正常生理活動及內部穩態的一種代謝活動，其作用機理是通過溶酶體降解來清除自身異常組分或細胞通過降解自身組分來解決外界營養匱乏的問題(Matsushita, 2007)。目前，在酵母中已經發現了40個自噬相關基因(autophagy- related gene,)(衛亞平, 2016)，眾多自噬相關基因中，被證明是微自噬和巨自噬的重要標志(Mizushima, 1999; 王懿崢等, 2018)，與共軛結合形成異源二倍體，后又與共價結合，形成類泛素結合系統，共同轉運到自噬體膜上(Matsushita, 2007; 陳立德等, 2017)，參與自噬體膜的延伸和擴張以及最終包裹內容物形成自噬體的過程(Klionsky, 2003)，被廣泛作為研究自噬行為的對象(Simonsen, 2008; Egan, 2011; Wei, 2016)。已有研究表明，在動植物應對逆境脅迫時表達量會明顯上調，與野生型相比，過表達番茄()的耐高溫、耐旱和耐高鹽等性能均有所提高(陳立德等, 2017; 賈昕, 2018)。在哺乳動物中，-共軛物參與小鼠()先天抗病毒免疫，促進小鼠的殺菌作用；參與牦牛()生殖過程中卵母細胞的發育、成熟和早期胚胎的發育(Jounai, 2007; 王靖雷等, 2019)。在魚類中，被證明在神經保護和先天免疫中發揮作用，且過表達會促進自噬活動(Hu, 2017; Chu, 2019)；斑節對蝦()在哈維氏弧菌()攻毒下，不論是干擾、單個基因或者2個基因同時干擾，其自噬水平均有所下降(劉偉, 2018)。

本課題組在中國對蝦轉錄組中發現，非生物脅迫下自噬相關基因差異表達(未發表)，鑒于自噬基因在其他物種中的研究進展，本研究對非生物脅迫下自噬相關基因所發揮的作用進行驗證。本研究通過克隆中國對蝦全長基因，分析其在各組織中的表達特征及其在pH脅迫、碳酸鹽堿度脅迫下的差異表達情況并驗證其功能，為中國對蝦在細胞自噬方面的研究提供參考，旨在為提高中國對蝦抗逆性和良種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用蝦取自山東日照開航水產養殖公司，選擇健康無病、規格整齊、活力旺盛的中國對蝦進行pH、碳酸鹽堿度脅迫及siRNA干擾實驗，所用對蝦體長為(11.59±0.96) cm，體重為(21.29±2.47) g。實驗用水為過濾后的地下海水，溫度為20℃～22℃，鹽度為26～28，pH 8.14～8.20。實驗前將蝦置于養殖池中暫養3～5 d。暫養期間，池中水深為30～40 cm，每天換水1/3，投喂餌料為中國對蝦體重的5%，待其適應環境后開展實驗。

1.2 組織采集

選取9尾未經處理的健康中國對蝦，取其鰓、肝胰腺、眼柄、肌肉、胃、心臟、腸和血淋巴細胞，每3尾為1組，放入凍存管中，迅速放入液氮保存，用于后續總RNA的提取以及組織表達分析。

1.3 實驗方法

1.3.1 pH、碳酸鹽堿度脅迫實驗 根據預實驗結果，pH脅迫實驗共分為2組，pH 8.2 (自然海水)為對照組，pH 9.0為脅迫組，每組設置3個平行，每個平行放入30尾中國對蝦，參照李政道(2018)和哈承旭等(2009)的實驗設計，使用NaOH、HCl和NaHCO3調節水體pH值。脅迫實驗在60 L的整理箱中進行。實驗開始前48 h調好水體pH值，當水體穩定后，將蝦放入整理箱中開始脅迫實驗。pH脅迫實驗開始后第0、3、6、12、24、48、72、96 h分別從每個實驗組隨機挑選9尾蝦，取其鰓組織，迅速放入液氮中保存，用于后續實驗中總RNA的提取。實驗開始后，每3 h測一次水體pH值并校正。

根據預實驗結果，將碳酸鹽堿度脅迫實驗分為 2組，堿度3.2 (自然海水)為對照組，堿度11為脅迫組，每組設置3個平行，每個平行放入30尾中國對蝦。參照柳飛(2016)和房文紅等(2000)的實驗設計，碳酸鹽堿度脅迫實驗使用Na2CO3和NaHCO3調節實驗水體堿度，用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl進行微調，實驗在60 L的整理箱中進行。實驗開始前48 h調好水體堿度，當水體堿度穩定后將蝦放入整理箱中開始脅迫實驗。碳酸鹽脅迫實驗開始后第0、3、6、12、24、48、72、96小時分別從每個實驗組隨機取出9尾蝦，取其鰓組織，迅速放入液氮中保存，用于后續實驗中總RNA的提取。實驗開始后，每3 h測1次水體堿度并校正，采用雙指示劑滴定法(酚酞和甲基橙作為指示劑)測定堿度。

1.3.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 先將收集的樣品進行預處理，體積較大的，如肌肉、肝胰腺，采用液氮研磨法處理，其他體積較小的樣品用低溫勻漿機處理。將處理好的樣品分裝至無RNA酶的離心管中，每管裝樣品80～100 mg，加入1 mL TransZol Up，每個組織取1管分裝好的樣品使用總RNA提取試劑盒(全式金，北京)提取總RNA，將提取的總RNA放入–80℃保存備用。使用超微量紫外分光光度計(Thermo, 美國)測定RNA質量和濃度，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。使用SMARTer?RACE 5′/3′ (寶生物，大連)試劑盒合成中國對蝦3′、5′RACE模板，用于基因克隆，–80℃保存。

1.3.3 中國對蝦基因克隆 從中國對蝦轉錄組中篩選自噬相關基因的EST序列。使用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物(表1)，通過PCR擴增得到中間片段，并使用DNAMAN軟件對其驗證。以驗證后的序列為模板，設計RACE引物，進行RACE擴增。將RACE擴增產物連接到T1載體(全式金，北京)后轉化到DH5α化學感受態細胞(全式金，北京)中，挑取單克隆菌株進行陽性克隆鑒定，通過菌液PCR產物的凝膠電泳結果，選出陽性菌液進行測序。使用軟件Contig Express拼接菌液測序結果，得到5′和3′端擴增序列；使用在線軟件ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找的開放閱讀框。

1.3.4 生物信息學分析 利用NCBI中的Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)區域，對核苷酸序列進行序列比對，使用Protein Blast比對與其他物種自噬相關基因的同源性。使用DNAMAN軟件進行多生物氨基酸序列對比。使用MEGA 7軟件構建N-J進化樹。使用SMART軟件預測蛋白質結構域，使用TMHMM Server v. 2.0軟件預測蛋白質有無跨膜結構，使用ExPASy中ProtParam tool預測蛋白質特性，使用ExPASy中ProtScale推測蛋白質親水性，使用SignalP 4.1 Server預測信號肽。

1.3.5基因siRNA干擾實驗 根據基因cDNA序列，設計3個干擾靶點，分別編號為ATG5-1、ATG5-2和ATG5-3 (表2)，進行預實驗。以注射無意義雙鏈siRNA-NC為陰性對照組，以分別注射ATG5-1、ATG5-2和ATG5-3作為干擾組，每組設置3個平行，每個平行放入10尾蝦，注射siRNA前稱量蝦的重量，根據蝦體重來調整注射量(1 μg/g)，注射部位為第2腹節肌肉，注射完成后放入裝有正常海水的60 L整理箱中。注射后24 h，每組中隨機選取3尾蝦，檢測干擾后基因在鰓中的表達變化，選出干擾效果最好的靶點進行正式實驗。siRNA干擾正式實驗設置4個實驗組：在pH 9.0、碳酸鹽堿度11.0脅迫下，注射無意義雙鏈siRNA-NC作為2個對照組，以注射效果最佳的靶點作為2個干擾組。實驗開始后統計脅迫48 h死亡率。

表1 本研究所用引物

Tab.1 The primers used in this research

表2 本研究所用siRNA序列與NC序列

Tab.2 The sequences of siRNA and NC used in this research

1.3.6基因表達的實時定量分析 利用PrimerPremier 5.0軟件設計實時熒光定量引物FcATG5-F1和FcATG5-R1(表1)。使用反轉錄試劑盒HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (諾唯贊，南京)將待測樣品RNA反轉錄得到cDNA。使用ChamQTMSYBR?Color qPCR master mix試劑盒(諾唯贊，南京)和7500 Real Time PCR System儀器(ABI，美國)檢測中國對蝦各組織表達分布及其在pH脅迫、碳酸鹽堿度脅迫下的表達。實時熒光定量結果使用2–ΔΔCt方法計算得出相對表達量，使用SPSS進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，運用Duncan多重比較進行顯著性檢驗，使用OriginPro 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 FcATG5基因序列分析

通過RACE技術得到中國對蝦基因序列，全長為2224 bp，將其命名為(GenBank登錄號：MW426527)，開放閱讀框為810 bp，5′端非編碼區107 bp，3′端非編碼區307 bp，編碼269個氨基酸(圖1)。信號肽預測結果顯示，FcATG5不包含信號肽。預測其編碼的蛋白分子量為31.103 kDa，理論等電點為5.59，親水性平均值為–0.407，不穩定性指數為43.43，表明該基因編碼的蛋白為疏水性不穩定蛋白，SMART軟件預測結果顯示，其具有1個APG5自噬相關蛋白結構域，不含跨膜結構。

2.2 FcATG5基因同源性分析及系統進化分析

使用DNAMAN軟件將FcATG5氨基酸序列與其他物種進行同源比對。結果顯示，中國對蝦FcATG5與凡納濱對蝦的同源性最高，為98.14%，與斑節對蝦的同源性為97.77%，與三疣梭子蟹()、日本沼蝦()、藍蟹()的同源性分別為85.50%、81.04%、78.32%(圖2)。

使用軟件MEGA 7.0構建Neighbor-Joining進化樹(圖3)。從圖3可以看出，進化樹分為兩大支，第一支為節肢動物門(Arthropoda)，第二支為脊索動物門(Chordata)。其中，中國對蝦隸屬節肢動物門、甲殼綱(Crustacea)，屬于第一支，與斑節對蝦、凡納濱對蝦首先聚為一支，其次為三疣梭子蟹、藍蟹。

2.3 FcATG5基因組織表達分析

利用實時熒光定量的方法檢測在中國對蝦不同組織中的表達情況。結果顯示，基因在中國對蝦各個組織中均有表達，但其在不同組織中的表達量不同，在肌肉中的表達量最高，其次在胃、眼柄中表達較高，在血淋巴細胞中表達量最低(圖4)。

2.4 pH、碳酸鹽堿度脅迫下FcATG5基因在中國對蝦鰓組織中的表達分析

鰓作為水生動物的呼吸器官，與養殖水體直接接觸，受水體pH、堿度等水體主要指標變化影響較大，也是水生動物調節體內滲透壓和維持內部穩態的重要調節器官。因此，本研究以中國對蝦鰓組織為主要研究對象。

pH脅迫3 h，基因在中國對蝦鰓組織中的表達量顯著高于對照組(<0.05)；在脅迫后96 h內，的表達呈現多峰式變化。脅迫后96 h，最高，為對照組的2.67倍；在48 h表達量相對最低，為對照組的1.68倍(圖5)。

圖1 FcATG5基因cDNA序列和預測的氨基酸序列

預測的開放閱讀框內核苷酸序列用大寫字母表示，位于氨基酸序列下方；起始密碼子(ATG)為下方劃紅線區域，終止密碼子(TGA)上方標有星號(*)

Nucleotide sequences in the predicted open reading frame are represented in capital letters below the amino acid sequence. The start codon (ATG) is the red line below, and the stop codon (TGA) is marked with an asterisk (*) above it

圖2 FcATG5基因與多種生物氨基酸序列比對

圖3 基于中國對蝦FcATG5氨基酸序列構建的Neighbor-Joining進化樹

圖4 FcATG5在中國對蝦各組織中的表達

G：鰓；HE：肝胰腺；ET：眼柄；M：肌肉；S：胃；H：心臟；I：腸；HL：血淋巴細胞；柱上不同字母代表表達差異顯著(<0.05)。下同

G: Gill; HE: Hepatopancreas; ET: Eye stalk; M: Muscle; S: Stomach; H: Heart; I: Intestines; HL: Hemolymph cells. Different letters on the column represent significant differences (<0.05). The same as below

與對照組相比，碳酸鹽堿度脅迫下在鰓組織中的表達變化呈顯著升高趨勢(<0.05)，。脅迫后96 h內，的表達基本呈先上調再下調的變化趨勢，在脅迫后12 h達到最高，為對照組的2.77倍；在96 h表達量最低，為對照組的1.30倍(圖6)。

圖5 pH脅迫下FcATG5基因在鰓中的相對表達

*：與對照相比，表達差異顯著(<0.05)。下同

*: Significant difference compared with control (<0.05). The same as below

2.5 FcATG5基因的功能驗證分析

2.5.1 siRNA干擾靶點篩選 siRNA干擾后，基因在中國對蝦鰓中的相對表達量如圖7所示。與對照組相比，注射不同干擾試劑24 h時，基因在鰓中的表達量呈顯著降低的趨勢(<0.05)。注射ATG5-1 24 h時，基因表達量為對照組的0.516倍；注射ATG5-2 24 h時，基因表達量為對照組的0.617倍；注射ATG5-3 24 h時，基因表達量為對照組的0.174倍。經比較，ATG5-3干擾效果最好，干擾效果達到82.6%，選擇干擾靶點ATG5-3進行后續實驗。

圖6 碳酸鹽堿度脅迫下FcATG5基因在鰓中的表達

圖7 注射ATG5-1、ATG5-2和ATG5-3 24 h時FcATG5基因在鰓中的表達

2.5.2 pH、碳酸鹽脅迫下干擾基因中國對蝦死亡率 向中國對蝦注射基因siRNA干擾試劑ATG5-3，并對其進行pH脅迫，統計其0～48 h內的死亡率，結果如圖8所示。干擾組在0～48 h的累計死亡率(50%)顯著高于對照組(33.33%) (<0.05)。其中，0～12 h干擾組死亡率為8.33%，對照組為0；12～24 h干擾組死亡率為25%，對照組為8.33%。

向中國對蝦注射基因siRNA干擾試劑ATG5-3，并對其進行高堿度脅迫，統計其0～48 h內的死亡率，結果如圖9所示。干擾組在0～48 h的累計死亡率(59.09%)顯著高于對照組(41.18%) (<0.05)。其中，0～12 h干擾組死亡率為9.09%，對照組為11.76%；12～24 h干擾組死亡率為31.82%，對照組為17.65%。

圖8 pH 9.0脅迫注射干擾的中國對蝦累計死亡率

圖9 碳酸鹽堿度11脅迫注射干擾的中國對蝦累計死亡率

3 討論

本研究運用RACE技術首次克隆得到中國對蝦基因cDNA全長，并對其進行分析。結果顯示，基因與其他物種，如太平洋鱈()(孫航等, 2015)、斑節對蝦(劉偉, 2018)的基因的預測結果相同或相似。開放閱讀框編碼的氨基酸序列與凡納濱對蝦等物種具有較高的同源性，且包含1個自噬相關蛋白結構域APG5，這表明基因所編碼的蛋白具有高度保守性。

中國對蝦基因的組織特異性表達分析結果顯示，基因在各組織中均有表達，無組織特異性，但在各組織中表達量差異性顯著，其中，在肌肉中表達量最高，在血淋巴細胞中表達最低，這與劉偉(2018)的研究結果一致。鰓是水生動物的呼吸器官，與養殖水體直接接觸，受水體pH、堿度等水體主要指標變化影響較大，也是水生動物調節體內滲透壓和維持內部穩態的重要調節器官。在pH和碳酸鹽堿度脅迫下，鰓作為主要的響應器官，在維持機體生理功能中發揮積極調控作用，而細胞自噬是免疫調控的重要部分，在水生動物應對脅迫時發揮重要作用(張小明, 2018; Li, 2018; 何麗等, 2019; 洋雯, 2019)。因此，推測在中國對蝦應對pH、碳酸鹽脅迫時發揮重要作用。研究自噬基因在中國對蝦應對鹽堿脅迫的機理，對于豐富中國對蝦應對鹽堿脅迫基礎性研究尤為重要。

研究表明，基因不僅能促進細胞自噬的形成，而且可以刺激細胞凋亡，在動物的先天免疫、神經保護、生殖發育等過程中發揮重要作用(Jounai, 2007; 王靖雷等, 2019)。作為細胞自噬的重要標志(Mizushima,1999; 王懿崢等, 2018)，根據其表達量的變化可推測細胞自噬水平的變化。本研究結果顯示，pH、碳酸鹽堿度脅迫下，中國對蝦鰓中表達量均有所升高，pH脅迫后96 h達到最高，碳酸鹽堿度脅迫后12 h達到最高，這與哈維氏弧菌刺激下，斑節對蝦中表達量上調，在72 h達到最高的研究結果相似(劉偉, 2018)。由此推測，鰓作為調節滲透壓、維持體內穩態的主要器官，在響應pH、碳酸鹽堿度脅迫時，其細胞自噬活動增強，且分別在脅迫后96 h和12 h達到最高水平。

RNA干擾技術是由dsRNA介導的基因沉默現象，研究人員通常利用RNA干擾技術進行基因功能的探索。已有研究表明，干擾會導致細胞自噬水平下降，而對進行過表達處理則會促進細胞自噬，這揭示了對細胞自噬的調控作用(劉偉, 2018; Chu, 2019)。研究表明，沉默癌細胞中基因可以提高化療藥物對癌癥的治療效果(Egan, 2011; Simonsen, 2008; Wei, 2016)；對斑馬魚()進行過表達處理，可以減輕或者逆轉帕金森氏病的病理特征(Hu, 2017)；沉默斑節對蝦中會使斑節對蝦細胞自噬水平下降(劉偉, 2018)。RNA干擾結果顯示，沉默會使中國對蝦死亡率升高，表明在pH、碳酸鹽堿度脅迫下，表達量越低，中國對蝦對非生物脅迫的耐受力越差，其存活率就越低。推測原因為沉默后，其表達量下降，進而抑制了細胞自噬水平，降低了中國對蝦的免疫力及抗逆性。這一結果與上述沉默動物或癌細胞中的相關研究結果相似。

非生物脅迫下，中國對蝦體內積累大量活性氧中介物(ROS)，使得機體受到氧化損傷，導致線粒體核糖體蛋白等受到損傷，產生功能性障礙(Li, 2021)。自噬相關基因通過調控細胞自噬過程來清除體內受損傷的細胞器和老化、錯誤折疊蛋白等，也可通過降解自身組分來解決外界營養匱乏的問題，維持機體內部相對穩態(高婷等, 2018)，由此推測，通過調控細胞自噬水平來清除由于非生物脅迫而受損傷的線粒體及蛋白質等。此外，自噬通過對葡萄糖的攝取、糖酵解關鍵酶和線粒體的調控來參與糖代謝過程(楊照國等, 2015)。中國對蝦在應對非生物脅迫時機體耗能增加，糖代謝活動增強(He, 2019)，由此推測，自噬基因可能通過此路徑為機體在應對非生物脅迫時供能，從而降低中國對蝦應對脅迫時的死亡率。本研究對在非生物脅迫中的作用進行了初步驗證，但其對細胞自噬過程的調控機制以及其所在自噬通路的調控網絡有待進一步研究。

CHEN L D, LI A, LIU Z J,. Effects of different environmental stresses on the number of autophagosomes and expression of autophagy-related genes in ‘Ningyu’ strawberry leaves. Acta Horticulturae Sinica, 2017, 44(10): 1894–1904 [陳立德, 李傲, 劉眾杰, 等. 逆境脅迫對‘寧玉’草莓葉片自噬小體數量及其相關基因表達的影響. 園藝學報, 2017, 44(10): 1894–1904]

CHEN X Z, LAI Q F, YAO Z L,. Technical model of green aquaculture in saline-alkali water. China Fisheries, 2020(9): 61–63 [陳學洲, 來琦芳, 么宗利, 等. 鹽堿水綠色養殖技術模式. 中國水產, 2020(9): 61–63]

CHU P F, HE L, YANG C,. Grass carp ATG5 and ATG12 promote autophagy but down-regulate the transcriptional expression levels of IFN-I signaling pathway. Fish and Shellfish Immunology, 2019, 92: 600–611

EGAN D, KIM J, SHAW R J,. The autophagy initiating kinase ULK1 is regulated via opposing phosphorylation by AMPK and mTOR. Autophagy, 2011, 7(6): 643–644

FANG W H, WANG H, LAI Q F. Toxicity of carbonate- alkalinity and pH to larval. Journal of Fishery Sciences of China, 2000, 7(4): 78–81 [房文紅, 王慧, 來琦芳. 碳酸鹽堿度、pH對中國對蝦幼蝦的致毒效應.中國水產科學, 2000, 7(4): 78–81]

FENG W Y, YAO J, ZHAO Y,. Experiment on the cultivation ofin saline-alkali water.Modern Agriculture, 2020(4): 13–14 [馮偉業, 姚靜, 趙悅, 等. 利用鹽堿水養殖南美白對蝦試驗. 現代農業, 2020(4): 13–14]

GAO T, WANG Z X, CHEN Z M,. Oxidative stress and autophagymediated by reactive oxygen species. China Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2018, 45(3): 656–662 [高婷, 王子旭, 陳祝茗, 等. ROS介導的氧化應激與自噬.中國畜牧獸醫, 2018, 45(3): 656–662]

GE Q Q, LI J, WANG J J,. Characterization, functional analysis, and expression levels of three carbonic anhydrases in response to pH and saline-alkaline stresses in the ridgetail white prawn. Cell Stress and Chaperones, 2019, 24(3): 503–515

HA C X, LIU P, HE Y Y,. Effects of high pH on immune enzymes of “Huanghai No.1” population of shrimp. Journal of Fishery Sciences of China, 2009, 16(2): 303–306 [哈承旭, 劉萍, 何玉英, 等. 高pH脅迫對“黃海1號”中國對蝦免疫相關酶的影響. 中國水產科學, 2009, 16(2): 303–306]

HAN S, HU W, LI C L,. Effects of pH stress on survival rate, growth and antioxidant enzyme activities of the sea cucumber,selenka. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(5): 91–98 [韓莎, 胡煒, 李成林, 等. pH脅迫對刺參存活、生長及抗氧化酶活性的影響. 漁業科學進展, 2018, 39(5): 91–98]

HAN X, HE Y Y, LI J,. Correlation between the SNP of NAGase gene and susceptibility to high pH stress in. Progress in Fishery Sciences, 2021, 42(1): 124–133 [韓旭, 何玉英, 李健, 等. 中國對蝦NAGase基因SNP標記的篩選及與耐高pH性狀的關聯分析. 漁業科學進展, 2021, 42(1): 124–133]

HE L, RUAN J M, LIU Y,. Cloning of, an autophagy gene, and its expression under Microcystin-LR stress in grass carp. Acta Hydrobiologica Sinica, 2019, 43(3): 479–485 [何麗, 阮記明, 劉毅, 等. 草魚自噬相關基因的克隆及其在MC-LR脅迫下的表達特征. 水生生物學報, 2019, 43(3): 479–485]

HE Y Y, LI Z X, ZHANG H E,. Genome-wide identification of Chinese shrimp () microRNA responsive to low pH stress by deep sequencing. Cell Stress and Chaperones, 2019, 24(4): 689–695

HU S, HE Y Y, LI J,. Expression analysis of the V-ATPase subunit c under the condition of high pH stress in. Journal of Fishery Sciences of China, 2019, 26(6): 1064–1074 [胡碩, 何玉英, 李健, 等. 中國對蝦V-ATPase亞基基因的克隆及其在高pH脅迫下的表達分析. 中國水產科學, 2019, 26(6): 1064–1074]

HU Z Y, CHEN B, ZHANG J P,. Up-regulation of autophagy- related gene 5 () protects dopaminergic neurons in a zebrafish model of Parkinson?s disease. Journal of Biological Chemistry, 2017, 292(44): 18062–18074

JIA X. Functional analysis of apple autophagy-related gensandin response to drought and high temperature stresses. Master′s Thesis of Northwest A&F University, 2018 [賈昕. 蘋果自噬相關基因和在干旱、高溫逆境中的功能分析. 西北農林科技大學碩士研究生學位論文, 2018]

JOUNAI N, TAKESHITA F, KOBIYAMA K,. The Atg5–Atg12 conjugate associates with innate antiviral immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007, 104(35): 14050–14055

KLIONSKY D J, CREGG J M, DUNN W A Jr,. A unified nomenclature for yeast autophagy-related genes. Developmental Cell, 2003, 5(4): 539–545

LI R P, ZHANG X X, LIU Z,. Distribution characteristics and relationships of pH, nutrients, chlorophyll-and three sulfonamides in pond aquaculture water. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2015, 9(6): 2582–2588 [李瑞萍, 張欣欣, 劉卓, 等. 池塘養殖水體pH、營養鹽、葉綠素及3種磺胺類抗生素分布特征及其相關性分析. 環境工程學報, 2015, 9(6): 2582–2588]

LI X P, CHI H, ZHANG J. Beclin-1 is involved in tongue soleimmune defense against bacterial infection. Fish and Shellfish Immunology, 2018, 77: 8–12

LI Z D. The role of Na+/H+exchanger and carbonic anhydrase inin response to pH stress. Master′s Thesis of Shanghai Ocean University, 2018 [李政道. 鈉氫交換體和碳酸酐酶在中國對蝦響應pH脅迫中的功能研究. 上海海洋大學碩士研究生學位論文, 2018]

LI Z X, TANG X Q, LI J,. Comparative proteomic and transcriptomic analysis reveals high pH-induced expression signatures of Chinese shrimp. Functional and Integrative Genomics, 2021, 21(2): 299–311

LIU F, LI J, LI J T,. Effects of carbonate alkalinity stress on the survival, growth, reproduction, and immune enzyme activities of. Journal of Fishery Sciences of China, 2016, 23(5): 1137–1147 [柳飛, 李健, 李吉濤, 等. 碳酸鹽堿度對脊尾白蝦生存、生長、繁殖及免疫酶活性的影響. 中國水產科學, 2016, 23(5): 1137–1147]

LIU F. Effects of carbonate alkalinity stresses on the growth and reproduction of. Master′s Thesis of Shanghai Ocean University, 2016 [柳飛. 碳酸鹽堿度對脊尾白蝦生長和繁殖的影響. 上海海洋大學碩士研究生學位論文, 2016]

LIU W. Mechanism of miR-7562 mediated ATG5-ATG12 conjugation system in response tostress in. Master′s Thesis of Shanghai Ocean University, 2018 [劉偉. 斑節對蝦miR-7562介導下ATG5-ATG12共軛系統應答哈維弧菌脅迫的作用機制研究. 上海海洋大學碩士研究生學位論文, 2018]

LIU Y, YU R H, ZHANG Z,. Effects of different pH on embryonic development and larval growth and development of bay scallop. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(6): 108–114

LUCIA S H, DANIELA U, WU Y,. Effluent, nutrient and organic matter export from shrimp and fish ponds causing eutrophication in coastal and back-reef waters of NE Hainan, tropical China. Continental Shelf Research, 2013, 57: 92–104

MATSUSHITA M, SUZUKI N N, OBARA K,. Structure of Atg5-Atg16, a complex essential for autophagy. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282(9): 6763–6772

MININA E A, MOSCHOU P N, VETUKURI R R,. Transcriptional stimulation of rate-limiting components of the autophagic pathway improves plant fitness. Journal of Experimental Botany, 2018, 69(6): 1415–1432

MIZUSHIMA N, NODA T, OHSUMI Y. Apg16p is required for the function of the Apg12p-Apg5p conjugate in the yeast autophagy pathway. EMBO Journal, 1999, 18(14): 3888– 3896

SIMONSEN A, CUMMING R C, BRECH A,. Promoting basal levels of autophagy in the nervous system enhances longevity and oxidant resistance in adult. Autophagy, 2008, 4(2): 176–184

SUN H, MAO M G, JIANG J L,. Cloning and expression of ATG5 gene in Pacific cod. Journal of Dalian Ocean University, 2015, 30(5): 478–483 [孫航, 毛明光, 蔣潔蘭, 等. 太平洋鱈ATG5基因的克隆及表達分析. 大連海洋大學學報, 2015, 30(5): 478–483]

SUN J Q. Technique of tilapia sheath and tail white shrimp in saline water pond. Chinese Fisheries, 2018(12): 103–105 [孫家強. 鹽堿水池塘羅非魚套養脊尾白蝦技術. 中國水產, 2018(12): 103–105]

WANG J L, PANG Y Y, MA R,. Cloning of yak’s ()and its expression in the main reproductive organs. Acta Theriologica Sinica, 2019, 39(5): 546–555 [王靖雷, 潘陽陽, 馬睿, 等. 牦牛基因克隆及其在輸卵管、卵巢和子宮中的表達定位. 獸類學報, 2019, 39(5): 546–555]

WANG Y Z, CHEN Y, YU L. The discovery and research of autophagy. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2018, 34(3): 229–239 [王懿崢, 陳揚, 俞立. 自噬的前世今生. 中國生物化學與分子生物學報, 2018, 34(3): 229–239]

WANG Y, LI J, ZHANG Z,. Effects of pH stress on antioxidant system enzyme activities and gene expression of. Progress in Fishery Sciences, 2013, 34(5): 43–50 [王蕓, 李健, 張喆, 等. pH、氨氮脅迫對中國對蝦HSP90基因表達的影響. 漁業科學進展, 2013, 34(5): 43–50]

WEI J, LONG L Y, YANG K,. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology, 2016, 17(3): 277–285

WEI Y P. Systematic study of ATG genes in the regulation of yeast autophagy. Master′s Thesis of Huazhong University of Science and Technology, 2016 [衛亞平. ATG基因調控酵母自噬的系統研究. 華中科技大學碩士研究生學位論文, 2016]

YANG W. Functional study on the involvement of Beclin-1, AMPKβ and Akirin in antibacterial immunity in Chinese mitten crab. Master′s Thesis of Dalian Ocean University, 2019 [洋雯. Beclin-1、AMPKβ和Akirin參與中華絨螯蟹抗細菌免疫的功能研究. 大連海洋大學碩士研究生學位論文, 2019]

YANG Z G, ZHANG X D, TANG S L,. Research progress of autophagy on regulation of energy metabolism in tumor cells. Chinese Journal of Bases and Clinics in General Surgery, 2015, 22(12): 1525–1529 [楊照國, 張小東, 唐世磊, 等. 自噬對腫瘤細胞能量代謝調控的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(12): 1525–1529]

YAO Z L, WANG H, ZHOU K,. Effects of water carbonate alkalinity and pH on survival rate of post-larval. Chinese Journal of Ecology, 2010(5): 945–950 [么宗利, 王慧, 周凱, 等. 碳酸鹽堿度和pH值對凡納濱對蝦仔蝦存活率的影響. 生態學雜志, 2010(5): 945–950]

YAO Z L, YING C Q, ZHOU K,. Gene expression profiles ofin response to carbonate alkalinity stress. Journal of Fishery Sciences of China, 2012, 19(1): 1–12 [么宗利, 應成琦, 周凱, 等. 碳酸鹽堿度脅迫下凡納濱對蝦基因的差異表達. 中國水產科學, 2012, 19(1): 1–12]

ZHANG X M. Preliminary study on the cause and mechanism of white spot syndrome virus (WSSV) pathogenicity to Chinesemitten crab (). Master′s Thesis of Shanghai Ocean University, 2018 [張小明. 白斑綜合征病毒(WSSV)對中華絨螯蟹()致病的原因及機制初步研究. 上海海洋大學碩士研究生學位論文, 2018]

ZHAO X Y, LI J, LI J T,. Effects of pH stress on non-specific immune factors and RNA/DNA ratio of. Progress in Fishery Sciences, 2011, 32(1): 60–66 [趙先銀, 李健, 李吉濤, 等. pH脅迫對日本對蝦非特異性免疫因子及RNA/DNA比值的影響. 漁業科學進展, 2011, 32(1): 60–66]

Cloning ofGene ofand Expression Analysis under pH and Carbonate Alkalinity Stress

WEI Wei1,2, HE Yuying2, LI Zhaoxia1①, ZHOU Yuxin3, LI Jian2, XIE Yongjun4

(1. School of Marine Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266237,China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao, Shandong 266071,China; 3. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306,China; 4. Hebei Provincial General Station of Aquatic Products and Fishery Environmental Monitoring and Protection, Shijiazhuang, Hebei 050011,China)

The full-length cDNA ofinwas cloned using rapid amplification of cDNA end (RACE) technology and named. The tissue expression ofand its expression characteristics under pH and carbonate alkalinity stress were analyzed using quantitative PCR. The function ofwas verified using RNAi. Gene analysis showed that thegene cDNA consisted of 2225 bp with an open reading frame of 810 bp, encoding 269 amino acids, and has a predicted protein molecular weight of 31.103 kDa and a theoretical isoelectric point of 5.59. It is a hydrophobin, contains an autophagy-related protein domain (APG5), has no transmembrane structure, and does not contain signal peptides. The homology and phylogenetic analysis showed thatwas highly conserved and had the highest homology with, reaching 98.14%. The tissue expression analysis showed thatwas expressed in all tissues of, with the highest expression in muscle, and the lowest expression in blood lymphocyte (<0.05). The expression level ofin the gill tissue was the highest at 96 h after pH stress, 2.67 times higher than that of the control group, and was the lowest at 48 h, which was 1.68 times higher than that of the control group. The expression level ofin the gill tissue was the highest at 12 h after the carbonate alkalinity stress, 2.77 times higher than that of the control group, and was the lowest at 96 h, which was 1.30 times higher than that of the control group. The results of the interference experiments showed that under pH and carbonate alkalinity stress, silencing thegene significantly increased the mortality of(<0.05), indicating that the higher the expression of this gene, the higher the survival rate of. The results of the study showed that the expression ofwas significantly increased under pH and carbonate stress (<0.05). It is speculated that autophagy may be involved in the regulation ofin response to abiotic stress. The results of this study are an important reference for the study of autophagy in aquatic animals, especially crustaceans, and will help advance the research of Chinese shrimp in saline-alkaline aquaculture systems.

;; pH stress; Carbonate alkalinity stress; RNAi

S917.4

A

2095-9869(2022)03-0084-11

10.19663/j.issn2095-9869.20210306001

http://www.yykxjz.cn/

魏威, 何玉英, 李朝霞, 周雨欣, 李健, 謝擁軍. 中國對蝦基因的克隆及其在pH、碳酸鹽堿度脅迫下的表達分析. 漁業科學進展, 2022, 43(3): 84–94

WEI W, HE Y Y, LI Z X, ZHOU Y X, LI J, XIE Y J. Cloning ofgene ofand expression analysis under pH and carbonate alkalinity stress. Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(3): 84–94

LI Zhaoxia, E-mail: zhx-l@163.com

* 國家自然科學基金項目(31772842)、財政部和農業農村部: 國家現代農業產業技術體系、中國水產科學研究院基本科研業務費(2020TD46)、山東省重點研發計劃項目(2019QYTPY022)和中央提前下達漁業成品油價格改革財政補貼項目(326-0501-YZN-Z4HB)共同資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31772842), China Agriculture Research System of MOF and MARA, Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2020TD46), Key Research and Development Program of Shandong Province (2019QYTPY022), and Central Government Issued the Financial Subsidy Project of Fishery Product Oil Price Reform in Advance (326-0501-YZN-Z4HB)]. 魏 威，E-mail: weiwei19960123@163.com

李朝霞，教授，E-mail: zhx-l@163.com

2021-03-06,

2021-04-04

(編輯 馮小花)