中華蛸vasa基因的克隆及表達分析*

劉宇巖 李鳳輝 邊 力 朱文靜 陳四清 曲江波 常 青 劉長琳 葛建龍

中華蛸基因的克隆及表達分析*

劉宇巖1,2李鳳輝2邊 力2朱文靜2陳四清2①曲江波3常 青2劉長琳2葛建龍2

(1. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 山東 青島 266071； 3. 煙臺開發區天源水產有限公司 山東 煙臺 264006)

基因編碼的蛋白是DEAD-box (Asp-Glu-Ala-Asp)蛋白家族成員，對真核生物生殖細胞的形成具有關鍵作用。本研究使用cDNA末端快速擴增技術(RACE)克隆了中華蛸()基因全長，共2438 bp，其中，開放閱讀框長2067 bp，編碼688個氨基酸，5′-UTR長128 bp，3′-UTR長244 bp (包含A尾巴)。基于ExPASy、Signal 4.1、TMHMM、SMART等在線軟件對基因的蛋白質結構進行預測，得出其氨基酸分子量為76580.53 Da，理論等電點為5.89。無信號肽，跨膜區域沒有明顯的信號，因此，推測其為胞內蛋白，不屬于膜蛋白。該蛋白具有DEXDc和HELICc 2個功能結構域，而且有9個DEAD-box家族蛋白的典型保守區域，表明所得cDNA屬于基因家族。使用qRT-PCR對中華蛸各時期胚胎、初孵幼體及2個發育時期的卵巢及雌雄不同組織的表達模式進行分析。結果顯示，基因在性腺中特異性表達，且在卵巢中的表達大于精巢，未成熟和成熟卵巢中均有mRNA表達，且未成熟期表達量較高。因此，推測基因可能在卵巢發育過程和功能維持等方面起到重要作用。在中華蛸早期胚胎發育階段，均能檢測到基因轉錄本，前10 d微弱表達，從第13天開始，表達量逐漸上升，至第19天達到最高。在初孵幼體階段，分別在第8天和第20天出現最低和最高表達量。本研究結果可為中華蛸原始生殖細胞起源、遷移和分化提供理論資料，有助于加深對中華蛸卵巢發育和卵子發生過程的理解。

中華蛸；；基因克隆；表達分析

基因編碼的蛋白是DEAD-box (Asp-Glu- Ala-Asp)蛋白家族成員，該蛋白參與多種細胞進程，如細胞RNA轉錄調節，RNA剪切、修飾和代謝，核內mRNA的運輸及降解等(Dehghani, 2015)。Schüpbach等(1986)首次在黑腹果蠅()中發現的存在，證明其屬母源基因，是生殖質的前體，在生殖細胞分化中發揮作用(Hay, 1988)。原始生殖細胞(PGCs)是由細胞分化而來，發育早期從體細胞中掉落，隨后經過一系列復雜的趨化因子作用發生轉移，至生殖脊時精卵結合促使原始性腺形成。隨后通過一系列的分裂增殖與分化過程，在性成熟階段由卵巢和精巢分泌成熟的配子(胡翔, 2015)。近年來，一些分子標記的發現幫助了PGCs的鑒定，硬骨魚PGCs的第1個分子標記是基因(Olsen,1997)。基因具有高度保守性，繼在果蠅體內被克隆后，在無脊椎動物和脊椎動物相繼展開研究，如家蠶() (Cao, 2012)、雞() (Tsunekawa, 2000)和小鼠()(Reunov, 2015)等。基因作為母源性基因，在生殖細胞中特異性表達，因此，可能在生殖發育的調控過程中發揮作用。目前，已在多種魚類成功克隆序列并得到其同源基因，如斑馬魚()(Kr?vel, 2004)、青鳉() (Herpin, 2007)、文昌魚() (Wu, 2011)和七彩神仙魚() (林睿涓等, 2017)等，并深入研究了在早期性腺分化及發育過程中發揮的作用。但未見有關中華蛸()基因的報道。

中華蛸屬于八腕目(Octopoda)、蛸科(Octopodidae)、蛸屬，在浙江、福建和廣東等近海區域廣泛分布。中華蛸喜穴居，肉質鮮美，蛋白質含量豐富且營養均衡(鄭小東等, 2011)，生鮮即食，加工后曬干也可，能食部分占比很高(92%以上)，頗受人們喜愛。中華蛸作為我國重要的經濟海產類，已開展了對其人工養殖及繁育的研究(蔡厚才等, 2009; 鄭小東等, 2011)，但目前對中華蛸繁育機制的研究仍處于探索階段。中華蛸卵母細胞發育不同步，屬分批產卵，給規模化苗種繁育增加了困難，工廠化養殖仍需努力。是生殖細胞的分子標記物，開展基因克隆和表達研究，可為中華蛸人工繁育和養殖提供理論依據。本研究以中華蛸為對象，運用cDNA末端快速擴增技術(RACE)克隆中華蛸基因，并使用熒光定量PCR技術(qRT-PCR)對其早期發育階段及各器官組織的表達狀況進行檢測，旨在完善中華蛸分子生物學和生殖調控方面的知識，為其生殖細胞的分化、早期性別鑒定及性別決定機制提供數據支撐，為實現工廠化繁育提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品制備

實驗用中華蛸親體在浙江南麂島海域捕獲，經長途運輸至山東省煙臺市牟平區天源水產有限公司進行人工培育，養殖水溫為23.2℃～25.6℃，鹽度為30～ 32，日換水量100%～200%。分別取活力旺盛、體質量為1.0～1.5 kg的雌雄成體中華蛸各3尾，觀察其右側第3條腕確認雌雄，經MgCl2(濃度為20 g/L)麻醉后迅速解剖，分別取其卵巢、精巢、鰓、心臟、腎臟、肝胰腺、大腦、視腺和皮膚。所用受精卵、孵化出膜后幼體均由成體中華蛸自然產卵、人工培育而來。培育水溫為23.8℃～26.0℃，溶氧> 5.0 mg/L，受精卵孵化27 d得到初孵幼體。幼體孵出后，移入專用水泥池(6 m×2 m×1.5 m)。根據幼體密度和大小投喂合適密度的鹵蟲()，并連續充氣確保氧氣充足，前3 d使用靜水培育，第4天使用流水，換水量為50%～ 70%，并進行吸底、排污。收集不同發育時間的受精卵(5、10、13、16、19、21、24和27 d)、孵化出膜后幼體(2、5、8、11、14、17、20、23和26 d)及未成熟、成熟期的卵巢若干，未成熟期體重為(182.31± 20.29) g，性腺指數(GSI)為(0.55±0.22)%，卵母細胞直徑在80～100 μm之間；成熟期體重為(1326±100) g，GSI為(5.19±0.81)%，卵母細胞直徑在400～500 μm之間。所有樣品均快速裝入含有RNA保存液的2.0 mL無酶管中，并在4℃冰箱放置12 h，保證保存液完全滲入組織。樣品帶回后貼上標簽，轉入–80℃冰箱，防止RNA降解，用于后續基因克隆和表達分析。

1.2 主要試劑

SMARTTMRACE cDNA amplification試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent with gDNA eraser反轉錄試劑盒、DNA Marker、PremixTM(TaKaRaTMV 2.0)大腸桿菌() DH5α菌株感受態細胞和pMDTM18T vector cloning試劑盒均購自TaKaRa公司，SteadyPure DNA凝膠回收試劑盒購自艾克瑞生物，動物組織總RNA提取試劑盒(DP431)購自天根生化科技有限公司，ChamQTMSYBR Color qPCR master mix試劑盒購自諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

本實驗總RNA的提取使用動物RNA提取試劑盒(DP431)，并參照其說明書提取中華蛸胚胎、孵化出膜后幼體各個時期和成體不同組織的總RNA。根據目的片段的長短采用不同濃度(1%～2%)的瓊脂糖制成凝膠，點樣后檢測RNA的質量(條帶是否清晰)，使用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, 美國)微量分光光度計檢測RNA的純度及濃度(用量1 μL)。5′RACE、3′RACE模板鏈的制備按照SMARTTMRACE cDNA amplification kit說明進行。

1.4 vasa基因核心序列克隆

從本實驗室構建的中華蛸轉錄組數據的注釋信息，篩選比對得到基因的部分cDNA序列。通過Primer 5.0軟件設計3對引物擴增核心序列(表1)，以中華蛸成熟卵巢組織cDNA為模板分別進行擴增。20 μL反應體系：10 μL PremixTM(LATMV2.0)，正向引物F (10 μmol/L) 0.8 μL，反向引物R (10 μmol/L) 0.8 μL，cDNA模板(1 μg/μL) 1 μL，ddH2O 6.4 μL補齊。反應程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃40 s，72℃ 1 min，35個循環；72℃延伸10 min。產物擴增完成后，在電泳板中檢測擴增條帶，切膠儀(DUT-48超薄型)下觀察合適的條帶，并用SteadyPure DNA回收DNA。純化后的DNA連接到pMD18-T vector中，連接體系：pMD18-T vector 1 μL, Solution Ⅰ 5 μL及DNA純化產物4 μL)，并置于PCR反應儀中反應3 h (16℃)。之后轉入冰上融化的DH5α感受態細胞過夜培養，篩選陽性單克隆并進行菌落PCR鑒定，將含有目的基因的菌液測序(華大基因)。

1.5 vasa基因全長克隆

測序后，經拼接比對確認為核心序列，設計RACE特異性引物5′GSP-1、5′GSP-2、3′GSP-1和3′GSP-2，使用巢式PCR進行3′和5′ RACE擴增，5′端擴增：5′RACE cDNA為模板，先用5′GSP-1與RACE通用引物UPM-long組合完成第1次反應；接著用第1次反應獲取的目的液稀釋后為模板，5′GSP-2與RACE通用引物UPM-short或NUP組合完成第2次反應。3′端擴增：3′RACE cDNA為模板，3′GSP-1與RACE通用引物UPM-long組合完成第1次反應；用第1次反應獲取的目的液稀釋后為模板，3′GSP-2與RACE通用引物UPM-short或NUP組合進行第2輪擴增。

PCR反應體系(20 μL)：10 μL PremixTM(LATMV 2.0)，3′或5′特異性引物(10 μmol/L) 0.8 μL，UPM (或NUP) 0.8 μL，RACE-cDNA模板(1 μg/μL) 1 μL，ddH2O 6.4 μL補齊。反應程序流程：94℃ 5 min；94℃ 30 s，3′和5′特異性引物退火溫度30 s，72℃ 1 min，反應30次；72℃ 10 min。獲取的產物檢測后進行回收、純化，之后連接轉化培養，挑陽性菌株測序(華大基因公司)。

1.6 vasa基因序列分析

測序完成的片段使用Contig Express 9.1軟件進行拼接、驗證，并用BLAST工具(https://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源性比對，確認實驗得到的cDNA是DEAD-box家族的基因。使用OFR Finder (http://www.ncbi.nlm.Nih.gov/projects/gorf/Orfig. cgi)在線軟件推導基因的開放閱讀框，利用ExPASy (https://web.expasy.org/compute_pi/)網站分析分子量、理論等電點，利用Signal4.1 (http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽，使用TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)進行跨膜區分析，利用SMART (http://smart.embl- heidelberg.de/)和NCBI (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測結構和功能結構域。將與其他已知物種的氨基酸序列使用NCBI進行同源蛋白比對，并使用DNAMAN對同源蛋白多重比較，利用MEGA 5.2軟件使用鄰近法(neighbor-joining)構建系統進化樹(Koichiro, 2011)。

1.7 實時熒光定量PCR

取不同發育時間的胚胎、孵化出膜后幼體、2個時期的卵巢和不同組織的總RNA，反轉錄為cDNA。將每個樣品濃度加無菌無酶水補齊至50 ng/μL，根據基因的核心序列，利用Primer 5.0設計2對熒光定量特異性引物-RT-F/R，以β-actin為內參基因，使用StepOneTMReal-time PCR system (IBM, 美國)，配制20 μL反應體系：ChamQTMSYBR color qPCR master mix (2×) 10 μL，ROX reference dyeⅠ(50×) 0.4 μL，-RT-F (10 μmol/L) 0.4 μL，-RT-R (10 μmol/L) 0.4 μL，cDNA模板(50 ng/μL) 2 μL，ddH2O 6.8 μL補齊。反應程序：95℃ 30 s (預變性)；(95℃ 10 s；60℃ 30 s，然后95℃15 s；60℃ 60 s；95℃ 15 s) 40個循環。所有檢測樣本設3個生物學重復，并設置3個技術重復，反應結束后查看熔解曲線是否正常。根據所測數據，采用2–??Ct法算出基因相對表達豐度，求其平均值±標準誤(Mean±SE)，使用SPSS 17.0軟件對表達量進行方差檢驗，<0.05被認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 Os-vasa基因序列分析

中華蛸基因全長為2438 bp，命名為其ORF長度為2067 bp，預測蛋白有688個氨基酸，5′-UTR長128 bp，3′-UTR長244 bp (包含A尾巴)，理論等電點為5.89，氨基酸分子質量76 580.53 Da，無信號肽，跨膜區域沒有明顯的信號，推測其為胞內蛋白，不屬于膜蛋白。具有基因的DEXDc和HELICc 2個功能結構域，且包含DEAD-box家族蛋白的典型特點：9個保守區域，分別為AQTGSGKT(I)、PVLTLLLQ (Q)、PTRELA (Ⅰa)、TPGRI (Ⅰb)、DEAD (Ⅱ)、SAT (Ⅲ)、RGLD (Ⅴ)、LVFVE (Ⅳ)和HRIGRTGR(Ⅵ)。另外，預測的氨基酸序列N端有多個RG重復序列，C末端存在基因常見的保守結構色氨酸(W)殘基和酸性氨基酸殘基(EEEE)，序列中存在多個GG重復序列(圖1)。

表1 本研究所用引物名稱和序列

Tab.1 Names and sequences of primers used in this study

2.2 氨基酸序列多物種比對及系統進化樹構建

通過在線軟件NCBI blastx和DNAMAN軟件，將中華蛸氨基酸序列與其他物種的基因編碼的氨基酸進行比對。結果發現，該氨基酸序列與加州雙斑蛸()同源性最高(98%)，其次是虎斑烏賊()(68.74%)、太平洋牡蠣()(67.36%)、蝦夷扇貝()(66.12%)、青螺()(65.15%)海兔()(63%)和紫貽貝()(62%)，與人類()、小鼠()同源性較低，分別為54%和53%。另外，DEXDc和HELICc 2個功能結構域的氨基酸序列保守性較高(圖2)。

為了分析基因在不同物種中的進化關系，利用MEGA 5.2軟件對中華蛸及其他13個物種的DEAD-box蛋白序列構建系統進化樹(圖3)，結果顯示，無脊椎動物和軟體動物，脊椎動物各聚一支，其中，中華蛸先與加州雙斑蛸、虎斑烏賊聚為一支，這表明它們的親緣關系較近，基因在頭足類中可能較為保守，獨立形成分支后再與軟體動物的腹足綱(Gastropoda)和瓣鰓綱(Lamellibranchia)聚為一支。在系統進化樹中呈現的結果與中華蛸在生物學分類中的地位基本一致。

2.3 vasa在不同發育時期及不同組織中的表達分析

在胚胎時期的qRT-PCR檢測結果如圖4所示，基因在發育前10 d微弱表達，從第13天開始，表達量逐漸上升，至第19天達到最高，之后表達量又開始下降，一直到孵化出膜。在仔蛸階段，從出膜到17日齡，基因表達量都維持在較低水平，8日齡幾乎檢測不到表達信號，從20～23日齡期間的表達量較高，且在20日齡表達量最高，后期階段(26和29日齡)又維持在較低水平(圖5)。

中華蛸雌性個體和雄性個體各組織的qRT-PCR檢測結果如圖6所示，基因無論在雌性還是雄性個體性腺組織的表達量均較高，在其他組織中表達量均很低，并且在卵巢中的表達量高于精巢。

取未成熟的卵巢和成熟期的卵巢進行qRT-PCR檢測，結果顯示(圖7)，未成熟卵巢表達量顯著高于成熟卵巢(<0.05)，未成熟期的表達量是成熟期的15.6倍左右。

3 討論

本研究從實驗室構建的中華蛸性腺轉錄組注釋中篩選得到基因的部分片段，并通過NCBI進行比對確認，使用RACE技術首次克隆了基因cDNA序列，并以命名其全長為2438 bp，共編碼688個氨基酸，理論等電點為5.89，氨基酸分子質量為76 580.53 Da。蛋白屬于DEAD-box蛋白家族，Ia-Ib和Ⅱ～Ⅵ這9個保守區域是DEAD-box家族蛋白共有的特點(Tanner, 2001)，在大部分DEAD-box蛋白家族成員中保守性表達。本研究得到的基因同樣發現了這9個保守基序的存在，每個保守基序都行使著特殊的生理功能，其中，Q motif框在ATP的結合與水解過程中發揮重要作用，谷氨酰胺殘基加上N可以參與氫鍵的形成，與功能性區域Ⅰ也有關聯，例如，相互配合促使ATP、RNA兩兩結合(Rocak, 2004)。motifⅠ～Ⅲ又可以相互作用形成一個ATP水解的作用口袋(Caruthers, 2002)。motifⅠa和motifⅠb則主要參與RNA的結合過程，motif Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ參與ATP酶和解旋酶的活性調節(Cordin, 2006)。經編碼氨基酸的多序列比對，在保守基序區域，物種間呈現高度保守性，僅有少數氨基酸殘基存在差異，表明基因在進化過程中較為保守。另外，在基因中發現了一些基因的普遍性特征，例如，存在多個GG重復序列，氨基酸C末端存在酸性氨基酸殘基，終止密碼子前端有1個色氨酸殘基。GG基序參與蛋白因子elF4A的相互作用(Rogers,2002)，C末端的酸性氨基酸殘基常與RNA結合過程有關(Fabioux, 2004)。RGG重復區也具有相似性，在昆蟲和脊索動物中普遍存在且大多數位于vasa蛋白的N端，但并不普遍存在于所有vasa蛋白，例如，在馬氏珠母貝() (劉雅等, 2017)、刺參() (隋娟等, 2008)的vasa蛋白的N端未發現RGG重復區的存在，本研究結果也是如此，說明這些序列并不是不可或缺的，其行使的功能具有可替代性。功能結構域結果顯示，基因具有DEADc和HELICc 2個結構域，這些都是vasa蛋白家族特有的，表明所得cDNA屬于基因家族且高度保守。

圖1 Os-vasa基因cDNA序列全長和編碼的氨基酸序列

起始密碼子ATG和終止密碼子TAA均用灰色陰影標出；PolyA用雙下劃線標出；GG重復序列、酸性氨基酸和色氨酸用方框標出；DExDc和HELICc 2個功能域用下劃線標出；陰影加方框部分是Os-vasa保守基序

Start codon (ATG) and stop codon (TAA) are marked with gray shadow, and PolyA is marked with double underline; Nucleotide with a frame represents GG repeat sequence, acidic amino acid and tryptophan; Open reading fragment; DExDc and HELICc functional domains are underlined; Sequences in gray background and frame represents the Os-vasa conserved motifs

圖2 中華蛸Os-vasa編碼氨基酸序列與其他物種同源序列比對

陰影部分表示氨基酸同源，左邊為物種名稱，右邊為比對到的氨基酸位置。各物種蛋白NCBI登錄號：加州雙斑蛸(KOF70288.1)、虎斑烏賊(CAE1321294.1)、太平洋牡蠣(XP_034310873.1)、蝦夷扇貝(XP_021370694.1)、青螺(XP_009057808.1)、海兔(XP_005113588.2)、紫貽貝(BAJ15435.1)

The shaded area indicates amino acid homology species. Species NCBI Login No:(KOF70288.1),(CAE1321294.1),(XP_034310873.1),(XP_021370694.1),(XP_009057808.1),(XP_005113588.2),(BAJ15435.1)

圖3 不同物種vasa蛋白系統進化樹

所用到的物種基因序列登錄號：蝦夷扇貝(XP_021370694.1)、歐洲大扇貝(XP_033738811.1)、紫貽貝(BAJ15435.1)、太平洋牡蠣(XP_034310873.1)、馬氏珠母貝(BAM75192.1)、青螺(XP_009057808.1)、海兔(XP_005113588.2)、虎斑烏賊(CAE1321294.1)、加州雙斑蛸(KOF70288.1)、人類(CAB70750.1)、小鼠(NP_034159.1)、環紋圓天竺鯛(XP_030008903.1)、深裂眶鋸雀鯛(XP_008278033.1)

The Accession number ofgene sequence were used:(XP_021370694.1),(XP_033738811.1),(BAJ15435.1),(XP_034310873.1),(BAM75192.1),(XP_009057808.1),(XP_005113588.2),(CAE1321294.1),(KOF70288.1),(CAB70750.1),(NP_034159.1),(XP_030008903.1),(XP_008278033.1)

圖4 Os-vasa mRNA在胚胎發育時期的相對表達量

柱上不同字母代表具有顯著差異(＜0.05)，下同

Bar with different letters indicate significant differences (0.05), the same as below

圖5 Os-vasa mRNA在不同發育時期仔蛸中的相對表達量

中華蛸氨基酸序列與其他物種基因編碼的氨基酸比對結果顯示，與加州雙斑蛸相似度較高，達98%。系統進化樹結果顯示，中華蛸蛋白先與加州雙斑蛸、虎斑烏賊聚為一支，預示中華蛸基因在生物體中發揮的功能與頭足類中其他物種高度相似，然后再與軟體動物中腹足綱和瓣鰓綱聚為一支，與脊椎動物則親緣關系較遠。在系統進化樹中的分子學進化地位與中華蛸的生物學分類地位是相符的。

圖6 Os-vasa mRNA在雌雄中華蛸不同組織中的表達

Br：大腦；He：心臟；Og：視腺；Ki：腎；Li：肝胰腺；Gi：鰓；Ca：胴肌；Sk：皮膚；Go：性腺

Br: Brain; He: Heart; Og: Optic gland; Ki: Kidney; Li: Liver; Gi: Gill; Ca: Carcass; Sk: Skin; Go: Gonad

圖7 Os-vasa mRNA在卵巢發育不同時期的表達

IO：未成熟卵巢；MO：成熟卵巢

IO: Immature ovary; MO: Mature ovary

基因組織qRT-PCR結果顯示，其在中華蛸卵巢和精巢中高表達，而在中華蛸其他組織中表達量較低，甚至檢測不到表達信號，差異極顯著(<0.01)。這一結果和多數報道的物種mRNA表達模式一致，如櫛孔扇貝()(邵明瑜等, 2007)、馬氏珠母貝、太平洋藍鰭金槍魚() (Nagasawa,2009)。研究表明，通過RNAi技術使用dsRNA處理太平洋牡蠣性腺會導致mRNA沉默，性腺mRNA表達水平明顯降低，vasa蛋白表達量也隨之降低或者不表達，且大部分太平洋牡蠣不育(Fabioux, 2009)。基因在生殖細胞的特異性表達模式表明其參與調控生殖細胞發育過程并發揮重要作用。也有研究發現，除在性腺組織中表達外，在其他組織也有表達，例如，在半滑舌鰨()(Hay, 1988)的心臟組織，在虹鱒()(Wu, 2014)的腦和心臟組織，在小鼠(Zamboni, 1983)的腎和腎上腺組織都檢測到基因的表達。基因不僅參與生殖細胞發育，還可能通過調節有關mRNAs的轉錄參與體細胞的分化(Ikenishi, 2000)。基因具體行使的功能隨著生物體的進化演變而存在差異，仍需要大量的研究工作來闡明。

?zhan-Kizil等(2009)研究表明，mRNA在夏威夷明鉤蝦()的1～16-細胞期均能檢測到，且32-細胞期前均定位在生殖細胞中；中國對蝦()最早從2-細胞期開始能檢測到mRNA的表達，且在后期表達沒有消失，但有減弱趨勢，出膜后表達信號消失(周倩如, 2007)。在模式生物斑馬魚中，mRNA表達信號貫穿整個胚胎發育時期，在胚胎發育早期存在于各個細胞中，并隨著胚胎的發育逐漸在生殖質區域聚集，mRNA是斑馬魚生殖質的重要組成成分(周倩如等, 2007)。本研究中，mRNA在發育10 d前微弱表達，從第13天開始表達量逐漸上升，至19 d達到最高，之后表達量又開始下降。在斑馬魚、櫛孔扇貝中，mRNA具有母源性特征遺傳，在生殖過程中，隨著配子的發生傳遞給下一代，分配到原始生殖質中，即早期mRNA是由母系基因組傳遞給胚胎的(徐紅艷等, 2010)。中華蛸可能在第13天細胞發生了分化，體細胞分化為原始生殖細胞(PGCs)，原始生殖細胞逐漸積累并在第19天達到頂峰。隨后從21 d到出膜階段，各個組織器官逐漸發育形成，是體細胞分裂生殖的時期，體細胞數量大增，而生殖細胞的數量所占的比例減少，因此，mRNA表達逐漸降低。這一表達結果和七彩神仙魚相似(林睿涓等, 2017)，推測中華蛸的原始生殖細胞在13 d時形成。基因在不同發育時期仔蛸中的表達結果顯示，從出膜到17日齡，基因表達量都維持在較低水平，8日齡幾乎檢測不到表達信號，這可能因為隨著受精過程的發生，母源性的mRNA被激活以維持合子早期發育所需，隨著發育的進行，母源性mRNA逐漸被消耗，仔蛸完成正常的生命活動則需依賴于自身基因組合成轉錄產物(許莉佳等, 2012)；隨著發育的推進，PGCs將穿過胚胎各組織(體細胞組織)在性原基聚集，并結合周圍的體細胞，形成完整的初始生殖腺，進而分化為卵巢或精巢(朱新平等, 2017)。七彩神仙魚出膜后30日齡和40日齡的表達量較高，認為PGCs在分子水平可能已經開始分化(林睿涓等, 2017)。本研究結果與其相似，出膜后第20天和第23天mRNA表達量較高，之后又維持穩定，推測第20天和第23天中華蛸的PGCs在分子水平可能已經開始分化，但這時期的高表達與性腺分化是否有關，仍需進一步在組織學水平進行鑒定。

未成熟的卵巢和成熟期的卵巢RT-qPCR檢測結果顯示，中華蛸未成熟和成熟卵巢均有mRNA表達，并且未成熟期表達量較高。斑馬魚卵母細胞原位雜交結果顯示，在卵母細胞的各階段，mRNA表達量存在差異，在Ⅱ期卵母細胞表達量最高，且定位到細胞質中，在第Ⅲ期開始下降并在后期表達量趨于穩定(項方, 2004)。對中華鱉()卵子發生的4個時期進行熒光原位雜交，在初級卵母細胞和最早期生長期卵母細胞檢測出高表達信號，并認為與細胞進行RNA和蛋白質的儲存有關，從生長期后表達信號逐漸減弱(朱新平等, 2017)。革胡子鯰()在性腺發育階段qRT-PCR相關實驗表明，與成熟卵母細胞(Ⅲ期和Ⅳ期卵母細胞)相比，未成熟卵母細胞(Ⅰ期和Ⅱ期)的轉錄本較高(Raghuveer, 2010)。在羅非魚(spp)(Kobayashi, 2000)和銀鯽()(Xu, 2005)的研究中也有同樣發現。中華蛸mRNA在雌性生殖細胞的表達圖譜與它們較為類似，未成熟期表達量較高，可能與此時期卵母細胞中RNA、蛋白質等物質大量積累有關；而在成熟期表達量減弱，這可能與轉錄產物的擴散使成熟卵細胞卵黃蛋白原的含量增加有關，而且隨著卵母細胞體積的增大，mRNA相對密度減少。mRNA在卵巢發育各時期的差異性表達表明，mRNA與卵子發生密切相關。

4 結論

本研究克隆了中華蛸基因cDNA的全長序列，并以命名，對中華蛸胚胎發育、初孵幼體、卵巢的不同時期與中華蛸不同組織進行了表達分析。結果顯示，中華蛸基因全長為2438 bp，其ORF長為2067 bp，編碼688個氨基酸。氨基酸同源性序列分析表明，中華蛸與加州雙斑蛸同源性最高。基因表達結果顯示，基因主要在性腺中表達，且在卵巢的表達量高于精巢；基因在中華蛸胚胎發育時期和出膜后29 d均有表達，胚胎期第19天表達量較高，出膜后第20天和第23天表達量較高；中華蛸未成熟和成熟卵巢均有mRNA表達，且未成熟期表達量較高。本研究結果可為中華蛸的性分化、生殖細胞分子標記及發育研究提供參考。

CAI H C, ZHUANG D G, YE P,. Experiment on stock culturing, spawning and hatching of. Marine Fisheries, 2009, 31(1): 58–65 [蔡厚才, 莊定根, 葉鵬, 等. 真蛸親體培育、產卵及孵化試驗. 海洋漁業, 2009, 31(1): 58–65]

CAO G L, ZHANG Y Y, XUE R Y,. Alternative splicing, expression patterns and promoter characters of-like gene from the silkworm,. Molecular Biology Reports, 2012, 39(5): 5967–5976

CARUTHERS J M, MCKAY D B. Helicase structure and mechanism. Current Opinion in Structural Biology, 2002, 12(1): 123–133

CORDIN O, BANROQUES J, TANNER N K,. The DEAD-box protein family of RNA helicases. Gene, 2006, 367: 17–37

DEHGHANI M, LASKO P. In vivo mapping of the functional regions of the DEAD-box helicase. Biology Open, 2015, 4: 450–462

FABIOUX C, CORPOREAU C, QUILLIEN V,In vivo RNA interference in oyster-silencing inhibits germ cell development. FEBS Journal, 2009, 276(9): 2566–2573

FABIOUX C, POUVREAU S, ROUX F L. The oyster-like gene: A specific marker of the germline in. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004, 315(4): 897–904

HAY B, JAN L Y, JAN Y N. A protein component ofpolar granules is encoded byand has extensive sequence similarity to ATP-dependent helicases. Cell, 1988, 55(4): 577–587

HERPIN A, ROHR S, RIEDEL D,. Specification of primordial germ cells in medaka (). BMC Developmental Biology, 2007, 7(1): 3

HU X. The effect of atrazine on ICR mice′s oocyte development ability. Master′s Thesis of Shanghai Ocean University of Shandong Normal University, 2015 [胡翔. 阿特拉津對ICR小鼠卵母細胞發育潛能的影響. 山東師范大學碩士研究生學位論文, 2015]

IKENISHI K, TANAKA T S. Spatio-temporal expression ofhomolog, XVLG1, in oocytes and embryos: The presence of XVLG1 RNA in somatic cells as well as germline cells. Development, Growth and Differentiation, 2000, 42(2): 95–103

KOBAYASHI T, KAJIURA-KOBAYASHI H, NAGAHAMA Y. Differential expression ofhomologue gene in the germ cells during oogenesis and spermatogenesis in a teleost fish, tilapia,. Mechanisms of Development, 2000, 99(1): 139–142

KOICHIRO T, DANIEL P, NICHOLAS P,. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Narnia, 2011, 28(10): 2731–2739

KR?VEL A V, OLSEN L C. Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant ofzebrafishduring gonadal development. Developmental Biology, 2004, 271(1): 190– 197

LIN R J, GAO J Z, JIN S R,. Cloning and expression analysis ofgene inJournal of Shanghai Ocean University, 2017, 26(3): 330–338 [林睿涓, 高建忠, 金仕容, 等. 七彩神仙魚基因cDNA的克隆及表達分析. 上海海洋大學學報, 2017, 26(3): 330–338]

LIU Y, WANG Q H, HUANG R L,. Cloning and expression analysis ofgene from. Genomics and Applied Biology, 2017, 36(7): 2832–2839 [劉雅, 王慶恒, 黃榮蓮, 等. 馬氏珠母貝基因的克隆與表達分析. 基因組學與應用生物學, 2017, 36(7): 2832–2839]

NAGASAWA K, TAKEUCHI Y, MIWA M,. cDNA cloning and expression analysis of a-like gene in Pacific bluefin tuna. Fisheries Science, 2009, 75(1): 71–79

OLSEN L, AASLAND, RFJOSE A. A-like gene in zebrafish identifies putative primordial germ cells. Mechanisms of Development, 1997, 66(1/2): 95–105

?ZHAN-KIZIL G, HAVEMANN J, GERBERDING M. Germ cells in the crustaceandepend onprotein for their maintenance but not for their formation. Developmental Biology, 2009, 327(1): 230–239

RAGHUVEER K, SENTHILKUMARAN B. Cloning and differential expression pattern ofin the developing and recrudescing gonads of catfish,. Comparative Biochemistry and Physiology Part A, Molecular and Integrative Physiology, 2010, 157(1): 79–85

REUNOV A A, REUNOVA Y A. In mouse oocytes the mitochondrion-originated germinal body-like structures accumulate mousehomologue (MVH) protein. Zygote, 2015, 23(4): 501–506

ROCAK S, LINDER P. DEAD-box proteins: The driving forces behind RNA metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2004, 5(3): 232–241

ROGERS G JR, KOMAR A A, MERRICK WC. eIF4A: The godfather of the DEAD box helicases. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 2002, 72: 307–331

SHAO M Y. CDNA cloning and developmental expression patterns of reproduction-related DEAD-box family and boule genes fromDoctoral Dissertation ofQingdao Ocean University of China, 2007 [邵明瑜. 櫛孔扇貝生殖相關因DEAD-box家族和boule的cDNA克隆及其發育表達圖. 中國海洋大學博士研究生學位論文, 2007]

SUI J, ZHANG Z F, SHAO M Y,. Cloning and characterization of a-like gene inand its expression in tissues. Journal of Fishery Sciences of China, 2008, 15(3): 407–413 [隋娟, 張志峰, 邵明瑜, 等. 刺參-like基因克隆及其在組織中的表達分析. 中國水產科學, 2008, 15(3): 407–413]

TANNER N K, LINDER P. DExD/H box RNA helicases from generic motors to specific dissociation functions. Molecular Cell, 2001, 8(2): 251–262

TSUNEKAWA N, NAITO M, SAKAI Y,. Isolation of chickenhomolog gene and tracing the origin of primordial germ cells. Development, 2000, 127: 2741–2750

WU H R, CHEN Y T, SU Y H,. Asymmetric localization of germline markersand Nanos during early development in the amphioxus. Developmental Biology, 2011, 353(1): 147–159

WU X, WANG Z, JIANG J,. Cloning, expression promoter analysis ofgene in Japanese flounder (). Comparative Biochemistry and Physiology Part B, Biochemistry and Molecular Biology, 2014, 167: 41–50

XIANG F. The expression of zebrafishgene andgene during oogenesis. Master′s Thesis of Wuhan University, 2004 [項方. 斑馬魚基因和基因在卵母細胞發生過程中的表達. 武漢大學碩士研究生學位論文, 2004]

XU H Y, LI M Y, GUI J F,. Fish germ-cell. Scientia Sinica Vitae, 2010, 40(2): 124-138 [徐紅艷, 李名友, 桂建芳, 等. 魚類生殖細胞. 中國科學: 生命科學, 2010, 40(2): 124– 138]

XU H, GUI J, HONG Y. Differential expression ofRNA and protein during spermatogenesis and oogenesis in the gibel carp (), a bisexually and gynogenetically reproducing vertebrate. Developmental Dynamics, 2005, 233(3): 82–872

XU L J, ZHANG X, WU S,. Progress on research of germ-cell transplantation in fish. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2012, 24(3): 280–286 [許莉佳, 張薪, 伍莎, 等. 魚類生殖細胞移植的研究進展. 生命科學, 2012, 24(3): 280–286]

ZAMBONI L, UPADHYAY S. Germ cell differentiation in mouse adrenal glands. Journal of Experimental Zoology, 1983, 228(2): 173–193

ZHENG X D, LIU Z S, ZHAO N,. Embryonic development and paralarvae growth ofOceanologia et Limnologia Sinica, 2011, 42(2): 317–323 [鄭小東, 劉兆勝, 趙娜, 等. 真蛸()胚胎發育及浮游期幼體生長研究. 海洋與湖沼, 2011, 42(2): 317–323]

ZHOU Q R, SHAO M Y, ZHANG Z F. Structure characterization and application prospects ofprotein. Transactions of Oceanology and Limnology, 2007(4): 129–134 [周倩如, 邵明瑜, 張志峰.基因編碼蛋白的結構特征和應用展望. 海洋湖沼通報, 2007(4): 129–134]

ZHOU Q R. cDNA cloning and expression analysis of two DEAD-box family genes,and, fromMaster′s Thesis of Ocean University of China, 2007 [周倩如. 中國明對蝦()兩個DEAD-box家族基因和的克隆和表達分析. 中國海洋大學碩士研究生學位論文, 2007]

ZHU X P, XU H Y, ZHANG P Y,. Cloning and expression analysis ofin Chinese soft-shell turtle oocytes. Acta Hydrobiologica Sinica, 2017, 3(2): 306–313 [朱新平, 徐紅艷, 張飄逸, 等. 中華鱉基因克隆及在卵母細胞中的表達分析. 水生生物學報, 2017, 3(2): 306–313]

Cloning and Expression of theGene in the

LIU Yuyan1,2, LI Fenghui2, BIAN Li2, ZHU Wenjing2, CHEN Siqing2①, QU Jiangbo3, CHANG Qing2, LIU Changlin2, GE Jianlong2

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao, Shandong 266071, China; 3. Tianyuan Aquaculture Co., Ltd of Yantai Economic Development Zone, Yantai, Shandong 264006, China)

Thegene is a member of the DEAD-box family of proteins and plays a key role in the formation of germ cells ineukaryotes. In this study, we cloned the full length (2438 bp) ofcDNA ()rapid amplification of cDNA end (RACE) methods. With an open reading frame (ORF) of 2067 bp, encoding 688 amino acids, a 5′UTR of 128 bp, a 3′UTR of 244 bp, and included an A-tail. Based on ExPASy, Signal4.1, TMHMM, and SMART biological analysis, the ORF encoded a putative protein, with a predicted molecular weight of 76 580.53 Da, and the theoretical isoelectric point was 5.89. No signal peptide site was detected, and there was a significant signal in the transmembrane region; therefore, it was presumed to be an intracellular protein, and not a membrane protein. There were two domains, DEXDc and HELICc, and nine conserved motifs of the DEAD-box family, indicating that the cDNA cloned in this study belonged to the family of. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the expression patterns of thegene at different stages of the embryo and larva, in the ovaries at two growth stages, and in specific tissues for males and females. The results showed that thegene was especially expressed in the gonads, and the expression level in the ovary was significantly higher than that in the testis;mRNA was expressed in both immature and mature ovaries, and the transcript level of the immature stage was evidently higher than the mature stage, revealing that thegene might play an important role in the development process and the maintenance of ovarian functions.gene transcripts were detected at whole embryonic developmental stages, were weakly expressed first 10 days, and gradually increased from the 13th day to the highest level on the 19th day. In the larval stages,exhibited the lowest and highest expression on the 8th day post-hatching and the 20th day, respectively. The findings of this study can provide information for the study of primordial germ cell origin and migration and differentiation, and can contribute to the understanding of ovarian development and oogenesis of

;; Gene cloning; Expression analysis

S965

A

2095-9869(2022)03-0118-11

10.19663/j.issn2095-9869.20210407001

http://www.yykxjz.cn/

劉宇巖, 李鳳輝, 邊力, 朱文靜, 陳四清, 曲江波, 常青, 劉長琳, 葛建龍. 中華蛸基因的克隆及表達分析. 漁業科學進展, 2022, 43(3): 118–128

LIU Y Y, LI F H, BIAN L, ZHU W J, CHEN S Q, QU J B, CHANG Q, LIU C L, GE J L. Cloning and expression of thegene in the. Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(3): 118–128

CHEN Siqing, E-mail: chensq@ysfri.ac.cn

* 財政部和農業農村部：國家現代農業產業技術體系專項資金和中國水產科學研究院基本科研業務費(2020GH02)共同資助 [This work was supported by China Agriculture Research System of MOF and MARA, and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2020GH02)]. 劉宇巖，E-mail: 157107719@qq.com

陳四清，研究員，E-mail: chensq@ysfri.ac.cn

2021-04-07,

2021-04-29

(編輯 馮小花)