血管生成因子VEGF與子宮內膜異位癥血瘀證的相關性研究*

鄭萍萍，王小紅

1 福建中醫藥大學中醫學院 福建福州 350122

2 福建中醫藥大學附屬人民醫院婦產科 福建福州 350004

子宮內膜異位癥（Endometriosis，EMT）是指子宮內膜組織（腺體和間質）在子宮體以外的部位生長，主要癥狀為進行性加重的痛經、不孕、月經異常以及性交痛，嚴重影響婦女的生活質量和身心健康[1]。其發病機制尚無定論，多數學者認可郎景和教授的內膜細胞要完成黏附（Attachment）-侵襲（Aggression）-血管形成（Angiogenesis）的“AAA”發病模式[2]。血管生成是其中的重要環節。研究表明，血管內皮生長因 子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）是目前具有最強促血管生長作用的因子，在新生血管生成過程中起著關鍵性的調控作用[3，4]。中醫學認為，“瘀阻胞宮”是EMT的基本病機[5]，研究表明，VEGF與EMT血瘀證關系密切，活血化瘀藥物可有效降低EMT患者的血管生成因子水平，抑制異位內膜的發生發展，從而減輕患者的相關臨床癥狀[6-8]。但中醫界大多局限于藥物研究、臨床療效分析及動物模型研究；而EMT血瘀證的相關分子機制及中醫學現代基礎機制研究缺乏。本文通過檢測VEGF在EMT患者血清及異位內膜中的表達，并分析其與EMT血瘀證患者血瘀積分的相關性，以期為臨床EMT的中醫診治提供和補充現代基礎理論的支持和依據。

資料與方法

1 診斷標準

1.1 西醫診斷標準 參照第9版婦產科學[1]及2015年子宮內膜異位癥的診治指南[9]。

1.2 血瘀證診斷標準 采集的患者的臨床表現，將所得信息錄入“中醫健康狀態辨識系統”進行標準化辨證，參照朱文鋒《證素辨證學》進行診斷[10]。并通過加權閾值的方法，計算證素積分及分級，見表1。

表1 血瘀證素積分分級

2 入組標準

2.1 納入標準 均經術后病理確診且證素辨證屬血瘀證；月經規律，且術前3個月內未使用激素類藥物治療者；同意參加本次課題研究并簽署知情同意書。

2.2 排除標準 不符合診斷標準或術前3個月使用激素類藥物者；子宮內膜病變、癌前病變及惡性腫瘤患者；近期皮膚有燙傷、燒傷、挫傷等大面積損傷，可能影響研究結果的病史者。

3 一般資料

選取2020年1月-2021年1月于福建中醫藥大學附屬人民醫院婦科病房住院的患者120例，實驗組為術前證素辨證為血瘀證，行腹腔鏡手術術后病理確診EMT的患者60例；對照組為術前證素辨證為血瘀證，行腹腔鏡切除子宮術后病理診斷排除EMT及子宮腺肌病的患者60例。2組的年齡，血瘀積分及血瘀分級等一般資料比較，差異無統計學意義，2組具有可比性。見表2。

表2 2組一般資料比較

4 研究方法

4.1 標本的采集及保存 血清：于術前月經干凈后2～3d的清晨，空腹抽取2組患者靜脈血（肘部）5ml，靜置于常溫下1h，在3000 r/min轉速下離心20min，取上清液于凍存管，保存在-80℃冰箱中待檢，避免反復凍融。內膜組織：實驗組腹腔鏡術中取異位內膜組織（內膜異位囊腫壁組織），對照組子宮切除術后取子宮內膜組織，置于有RNA保護液中保存在凍存管中，于-80℃冰箱中保存待檢，避免反復凍融。

4.2 檢測方法 采用ELISA方法檢測血清中VEGF的水平：采用人血管內皮細胞生長因子（VEGF）試劑盒（MM-0115H1，酶免），實驗嚴格按照試劑盒說明書，采用全自動酶標儀（WD-2102B，六一）進行檢測，得到OD值和標準物的濃度，求出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式求出樣品濃度。采用Real-time PCR方法檢測內膜組織中VEGF mRNA的表達：采用超純RNA提取試劑盒（CW0581M，CWBIO，康為世紀）提取內膜組織中的mRNA并用紫外分光光度儀測定RNA濃度、純度，用5×HiScript II qRT SuperMix II進行逆轉錄反應，采用2×SYBR Green PCR Master Mix進行擴增，采用CFX Connect?實時熒光定量PCR儀進行擴增反應和熒光定量；并繪制擴增曲線及熔解曲線，運用2-△△CT法對數據進行相對定量分析。

5 統計學方法

統計分析采用SPSS 20.0統計學軟件，以P＜0.05有統計學意義。計量資料以（±s）表示，2組計量資料進行正態性檢驗，符合正態分布2組間比較采用t檢驗，不符合正態分布2組間比較采用秩和檢驗；多組計量資料采用單因素方差分析；計數資料采用卡方檢驗；兩變量相關性采用直線相關分析。

結 果

1 2組血清中VEFG及內膜中VEGF mRNA的表達

2組患者術前血清中VEGF水平及內膜組織中VEGF mRNA的相對表達量經非參數檢驗，結果顯示2組有差異，實驗組患者血清中VEGF及異位內膜組織中VEGF mRNA的水平均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 2組血清中VEFG及內膜中VEGF mRNA的表達情況比較（±s）

表3 2組血清中VEFG及內膜中VEGF mRNA的表達情況比較（±s）

組別 例數 VEGF/pg·ml-1 VEGF mRNA實驗組 60 94.74±19.976 3.08±1.554對照組 60 52.17±12.507 1.35±1.157 Z 9.127 6.477 P＜0.05 ＜0.05

2 EMT患者血清中VEGF及內膜中VEGF mRNA與血瘀積分的關系

EMT患者血清中VEGF及異位內膜組織中VEGF mRNA與血瘀積分經直線相關分析，結果提示EMT患者血清中VEGF及異位內膜組織中VEGF mRNA的表達與其血瘀積分均具有相關性，呈正相關，相關系數分別為r=0.543和r=0.556（P＜0.05）。見表4。

表4 EMT患者血清中VEGF及內膜中VEGF mRNA與血瘀積分關系比較

討 論

對于EMT的現代醫學的病因及發病機制的探究，主要包括子宮內膜異位種植學說、體腔上皮化生學說、誘導學說等。經血逆流種植學說認為在經期時，經血可帶著脫落子宮內膜組織，由輸卵管逆流入腹腔并種植于盆腔腹膜組織及卵巢上，不斷發展形成盆腔異位病灶[1，11]。但是“經血逆流”并不能完全闡明EMT的逆流后，子宮內膜在腹腔內的復雜的發病過程，郎景和[12]提出的發病三部曲AAA模式，補充并完善了經血逆流種植學說的分子生物學機制。血管生成是“3A”的發病模式中的重要環節。局部異位內膜的宮腔黏膜以外部位的生長取決于新生血管的形成，血管生成在EMT的發生、發展中扮演著重要的角色。VEGF[13，14]被認為是目前具有最強的促血管生長作用的一種血管生長因子。目前對于EMT，還缺乏高敏感度的臨床檢測方法，尋找無創的生物學檢測方法，能為疾病的早期診斷和治療，以及疾病的預防和隨訪提供有效的簡易的方法。

1 EMT患者血清中VEFG及內膜中VEGF mRNA的表達

VEGF是具有最高特異性的血管內皮細胞的有絲分裂劑，能誘導內皮細胞有絲分裂進行增生，促進局部新生毛細血管網結構的形成；能通過降解破壞細胞外基質，改變血管的通透性，使血漿蛋白及生長因子外滲，為局部新生組織提供營養和基質，促進新生毛細血管結構的塑造和成纖維細胞與血管內皮細胞形成組織間質[15]。本實驗結果顯示VEGF在2組患者的血清中的表達，差異具有統計學意義（P＜0.05），實驗組表達水平明顯高于對照組。同時，許曉月、崔軼凡等[16，17]研究表明，內異癥患者血清中可以發現VEGF，其血清中VEGF呈高表達。與本研究結論相一致。VEGF在EMT患者血清中表達存在異常，不僅能證明VEGF在本病發病中可能存在促進的作用，同時也為未來早期發現并診斷內異癥的檢測指標提供新的選擇。

VEGF主要在子宮內膜細胞的間質細胞、腺體細胞以及間質中的巨噬細胞和中性粒細胞等炎性細胞中表達[32]。VEGF在月經周期中子宮內膜的修復工作中也發揮著作用。內膜細胞在卵巢的激素的促進作用下能分泌VEGF，由于EMT的異位病灶和子宮在位的內膜腺體和間質具有組織同源性，所以異位內膜在卵巢的激素影響下也可分泌VEGF，VEGF可降解細胞外基質，破壞基質的屏障作用，改變局部的微環境，從而促進異位病灶的進一步發生和發展[18]。李燦宇等[19]實驗結果表明，VEGF在EMT的在位內膜及異位內膜的表達水平均高于在正常內膜組織中的水平，且VEGF在在位內膜及異位內膜中的水平比較，差異無統計學意義。本課題結果顯示，2組組織中VEGF mRNA的水平差異具有統計學意義（P＜0.05），異位內膜中的VEGF mRNA水平高于對照組，于上述研究結果相符合。在異位內膜中VEGF的高表達，能夠誘導內皮細胞的增殖，促進新血管的形成，使異位內膜得以成功種植、發展，異位病灶進一步浸潤、蔓延，不斷擴大對盆腔周圍組織的破壞，使盆腔周圍組織的粘連等病理變化呈持續性發展，可見異位病灶中VEGF的表達增高是異位病灶種植、蔓延的重要因素，在發生、發展中起重要作用。

2 EMT患者血清中VEGF及內膜中VEGF mRNA與血瘀積分的關系

中醫學普遍認為，本病的發病根本是“瘀血阻滯胞宮、沖任”，現代醫學認為子宮內膜異位癥的發病與經血逆流，內膜細胞在宮腔外的種植、浸潤及血管形成有關，這與中醫學的“離經之血”久而致瘀的理論相符合。而治療上，研究證實，抗VEGF抗體的抗血管生成藥物治療能有效延緩疾病發展，而中醫學的活血化瘀治療能明顯減低患者的血管生成因子水平，并且改善EMT患者臨床癥狀體征、減低術后復發率及提高受孕率[20]，治療方案上的原則、思路及療效上基本一致。通過現代醫學的微觀的分子生物學機制與中醫學的宏觀的臨床癥狀體征相結合，能夠探究中醫臨床證候的現代學的內在機理。本研究通過收集臨床癥狀體征計算血瘀證素積分，研究血瘀程度與VEGF的相關性發現：EMT患者血清中VEGF水平及內膜中VEGF mRNA的表達量與血瘀積分的關系，經直線相關分析顯示，兩者均呈正相關（P＜0.05）。EMT患者血清及內膜中的VEGF與血瘀積分均具有相關性。且其相關趨勢與前面論述的VEGF對疾病發生發展的作用相符合。為臨床EMT的中醫病機辨證診斷提供客觀的現代理論基礎及生物學機制支持，同時也為EMT的臨床中醫活血祛瘀等治療方案提供了新的現代學理論依據。

綜上所述，血管生長在EMT的發病過程中起著不可替代的重要作用，VEGF在血管生成的整個過程中都參與了調控的作用；VEGF與EMT血瘀證的證候內在本質之間存在相關性，為臨床EMT的中醫診治提供和補充現代基礎理論的支持和依據。