猴頭菌菌絲體發(fā)酵條件優(yōu)化研究

鞠正福 周巨川 董國秀

（1 青島市城陽區(qū)上馬街道辦事處農業(yè)農村服務中心，山東青島266112；2 青島藍佳生物科技有限公司，山東青島266112）

猴頭菌Hericium erinaceus，別名猴頭蘑、羊毛菌、猴頭菇，屬真菌界，擔子菌門，傘菌綱，多孔菌目，齒菌科，猴頭菌屬。猴頭菌是一種腐生菌，子實體為團塊狀、質地柔軟，子實體的中部和中下部為圓柱狀菌針，全形似刺猬或猴頭，子實體初期為白色，干后呈淺褐色，孢子呈球形，光滑無色[1-2]。

猴頭菌是一種藥食兩用菌，含多糖類及氨基酸，并含多肽類及草菌酸[3]。研究表明，猴頭菌不僅對消化系統(tǒng)疾病有特殊療效，而且還具有增強免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、保護神經和抗菌作用[4]。

猴頭菌人工栽培技術已較為成熟，但生產周期長、產量低且不穩(wěn)定。發(fā)酵培養(yǎng)猴頭菌菌絲體，成本低，周期短，產量高。目前關于猴頭菌深層發(fā)酵有關研究報道的結論還不完全一致[5-9]，劉艷芳等[5]研究得出最優(yōu)培養(yǎng)基主要為葡萄糖3%，可溶性淀粉2%，酵母膏1%；劉靈霞[6]研究得出液體培養(yǎng)猴頭菌的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源為蛋白胨；劉曉鵬等[8]報道可溶性淀粉和黃豆粉分別為最佳的碳源和氮源；信文娟等[9]篩選出葡萄糖3%，山藥粉0.4%，花生粉1%，玉米漿干粉0.6%為猴頭菌發(fā)酵培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基。由此可見，不同研究者得出的猴頭菌液體培養(yǎng)基配方存在很大差異。

試驗以猴頭菌菌絲體干重為評價指標，對猴頭菌液體培養(yǎng)基進行優(yōu)化，提高其菌絲體產量，為猴頭菌相關產品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）菌株：猴頭菌菌株CGMCC5.783，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

（2）培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基采用PDA 培養(yǎng)基，取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1 000 mL 煮沸30 min，濾去馬鈴薯塊，加葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加蒸餾水將濾液補足至1 000 mL，pH自然，115 ℃滅菌30 min。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，Mg‐SO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.15%，pH 自然，250 mL 三角瓶裝液量100 mL，115 ℃滅菌30 min。

（3）主要儀器設備：JL2004B 分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）、TMHS-50 恒溫恒濕培養(yǎng)箱（常州托曼儀器制造有限公司）、YXQ-LS-50S 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）、ZW-QH23 組合式振蕩培養(yǎng)箱（常州金壇中旺儀器制造有限公司）、YT-700 型電熱恒溫鼓風干燥箱（紹興滬越儀器設備有限公司）。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 猴頭菌斜面的制備

將0.5 cm2的猴頭菌菌絲塊接種于PDA 斜面培養(yǎng)基中，置于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，備用。

1.2.2 液體種子培養(yǎng)

在無菌條件下，將4 塊0.5 cm2的斜面猴頭菌菌絲接入裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，置于轉速為150 r/min 的搖床上26 ℃振蕩培養(yǎng)7 d，再次接入液體種子培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)7 d，備用。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將約7 d菌齡的菌種接入裝有100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中（250 mL 三角瓶裝液量100 mL）接種量為10%，置于26 ℃，轉速為150 r/min 搖床上振蕩培養(yǎng)10 d。

1.2.4 碳源篩選試驗

碳源主要考察對象為遲效碳源，為滿足菌絲體初期生長的養(yǎng)分需求，故添加葡萄糖10 g/L，另外添加蛋白 胨5 g/L，MgSO4·7H2O1 g/L，KH2PO41.5 g/L，VB10.01 g/L，在此基礎上分別添加可溶性淀粉、玉米粉（煮沸30 min，4 層紗布過濾取濾液，以下玉米粉處理相同）、甘蔗糖蜜、蔗糖、紅糖和甘油，添加量均為30 g/L，pH 5.5，在115 ℃條件下滅菌30 min。每個碳源處理3個重復。

1.2.5 氮源篩選試驗

葡 萄 糖 30 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO41.5 g/L、VB10.01 g/L，在此基礎上分別添加酵母粉、黃豆粉（煮沸30 min，4 層紗布過濾取濾液，以下黃豆粉處理相同）、豆粕粉、蛋白胨、牛肉粉，添加量均為10 g/L，pH 5.5，在115 ℃條件下滅菌30 min。每個氮源處理3個重復。

1.2.6 碳氮源正交試驗

選取碳源葡萄糖和玉米粉，氮源酵母粉和黃豆粉為因素進行正交優(yōu)化試驗，正交表選用L9（34），正交設計見表1。每個處理3個重復。

表1 碳氮源正交因素和水平 單位：g/L

1.3 菌絲體測定方法

用50 μm濾膜抽濾收集菌絲體，稱濕重并記錄，于60 ℃烘箱中干燥28 h至恒重，記錄菌絲體干重。

2 結果與分析

2.1 供試碳源對猴頭菌菌絲體生物量的影響

由圖1 可知，以玉米粉為碳源的培養(yǎng)基獲得的猴頭菌菌絲體生物量（菌絲干重，下同）最高（1.39%），以甘油為碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲體生物量最低。由此可知，猴頭菌對玉米粉的利用率最高，對甘油的利用率最低。葡萄糖是速效碳源，能夠在菌絲體生長初期快速提供碳源，玉米粉作為遲效碳源，在菌絲體生長后期有明顯的促進菌絲生長作用，所以最佳碳源選擇玉米粉和葡萄糖復配進行正交試驗。

圖1 供試碳源對猴頭菌菌絲體生物量的影響

2.2 供試氮源對猴頭菌菌絲體生物量的影響

以往研究表明，無機氮源不宜用于真菌培養(yǎng)[9]，故試驗全部用有機氮源。

由圖2 可知，以黃豆粉為氮源的培養(yǎng)基獲得的猴頭菌菌絲體生物量最高（1.41%），酵母粉其次，以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基獲得的菌絲體生物量最低。故選擇黃豆粉和酵母粉復配進行正交試驗。

圖2 供試氮源對猴頭菌菌絲體生物量的影響

2.3 復合碳氮源的正交試驗結果

圖3 菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)前期（左為第一次培養(yǎng)液體種子，右為轉接后液體種子）

圖4 菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)后期（培養(yǎng)第9天）

圖5 過濾后菌絲體（驗證試驗）

由表2 可知，組合5 的猴頭菌菌絲體干重最高，所對應培養(yǎng)基為玉米粉30 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉12.5 g/L，黃豆粉5 g/L。從K值分析看出各因素最大K值對應的試驗組合為A2B2C2D1，所對應的因素水平為玉米粉30 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，黃豆粉5 g/L。從R值看出RA＞RB＞RD＞RC，即四因素影響力大小比較為玉米粉＞葡萄糖＞黃豆粉＞酵母粉。

表2 復合碳氮源的正交試驗結果

由表3 正交試驗方差分析的F值可知，與其他因素相比玉米粉對猴頭菌菌絲體干重影響有顯著性差異。從F值大小比較四因素之間影響力大小，與表2中R值分析結果一致。

表3 復合碳氮源的正交試驗結果方差分析

從K值可知，最優(yōu)組合為玉米粉30 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，黃豆粉5 g/L，并不在9 組試驗內，對該組合重復3次驗證試驗，獲得菌絲體干重平均為25.1 g/L。

3 小結與討論

碳源是食用菌重要營養(yǎng)之一，單糖（如葡萄糖）可以直接被吸收，有利于菌絲體生長初期吸收利用。復合碳源原料具有資源豐富、成本低廉的優(yōu)點，是規(guī)模化生產的首選，所以最佳碳源選擇復配玉米粉和葡萄糖。

從菌絲體營養(yǎng)需求來看，氮源是最重要的營養(yǎng)來源，是合成氨基酸和核酸不可缺少的原料。氮源不足會嚴重影響菌絲體的生長。大多數食用菌利用有機氮的能力優(yōu)于利用無機氮[6]，復合氮源比單一組分氮源培養(yǎng)菌絲的生物量高，因為有機氮中含有一些微量元素，如金屬元素和生長因子等可促進菌絲體生長。

由單因素試驗和正交試驗最終確定適宜猴頭菌菌絲體生長的液體培養(yǎng)基為玉米粉30 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，黃豆粉5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO41.5 g/L，VB10.01 g/L，驗證試驗獲得猴頭菌菌絲體干重為25.1 g/L。

試驗結果為猴頭菌液體培養(yǎng)菌絲體提供數據支撐。