破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠免疫功能的影響

岑思恩 焦春偉* 隨晶晶 陳家明 謝意珍，2

（1廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東廣州510663；2廣東粵微生物科技有限公司，廣東廣州510663）

鐵皮石斛Dendrobium officinale，是蘭科石斛屬多年生草本植物，其活性成分包括多糖、生物堿、黃酮、揮發(fā)油等；具有增強免疫力、抗氧化、降尿酸、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖等藥理作用[1-3]。由于野生鐵皮石斛數(shù)量較少，價格昂貴，故目前鐵皮石斛相關(guān)產(chǎn)品多是復(fù)方制劑。鐵皮石斛通常與西洋參、靈芝、枸杞配伍使用。檢索國家市場監(jiān)督管理總局特殊食品信息查詢平臺，截至2022 年1 月，獲批準(zhǔn)的以鐵皮石斛為原料的保健食品共129 款，其中鐵皮石斛與靈芝配伍使用產(chǎn)品共11款，配伍頻次僅低于西洋參，且獲批功能均為增強免疫力，可見鐵皮石斛與靈芝復(fù)配具有增強免疫力功效，已獲得專家及市場的一致認可。靈芝Ganoderma lucidum，是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，靈芝孢子（Sporoderm-Broken Spore ofGanoderma lucidum）是靈芝成熟期釋放出的卵型生殖細胞，富含多糖、三萜和核苷等多種功效成分，具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[4-6]。靈芝孢子中部分活性物質(zhì)如總?cè)啤⒖偠嗵呛棵黠@高于靈芝子實體，同時在抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力等方面表現(xiàn)出更加明顯的效果[7]。因靈芝孢子具有堅硬的孢壁，孢子內(nèi)有效成分難以通過孢壁溶出而被人體吸收利用，其開發(fā)和應(yīng)用受到限制。得益于現(xiàn)代工藝的發(fā)展，通過破壁技術(shù)可有效地將孢壁打碎，使活性成分更易釋放，從而破壁靈芝孢子逐漸受到市場的關(guān)注[8-9]。

破壁靈芝孢子及鐵皮石斛同屬補益藥，有良好的保健食品開發(fā)前景。隨著中藥化學(xué)和藥理學(xué)的發(fā)展，多項動物試驗和人群試驗已驗證了破壁靈芝孢子粉及鐵皮石斛都具有増強免疫功能的作用[10-15]。目前，已有針對破壁靈芝孢子粉或鐵皮石斛單味中藥進行深入而細致的研究，但對于破壁靈芝孢子及鐵皮石斛復(fù)配組方的免疫功能的研究鮮有報道。破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉是以破壁靈芝孢子和鐵皮石斛組成的復(fù)方制劑，筆者參考衛(wèi)生與健康委員會（原衛(wèi)生部）《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003 年版）[16]對其增強免疫力作用進行研究，為其推廣應(yīng)用提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）試驗樣品：破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉樣品由廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司提供，由鐵皮石斛經(jīng)滅菌、干燥、粉碎后，與破壁靈芝孢子粉混合而成。樣品含粗多糖6%（硫酸-苯酚法）及總?cè)?%（香草醛-冰醋酸顯色法）。人體每日推薦食用量為2 g。試驗前將樣品用純凈水配制成各劑量。

（2）試驗動物：SPF級昆明種健康小鼠，體重18~22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)試驗動物中心提供，合格證號SCXK（粵）2013-0002，飼料由廣東省醫(yī)學(xué)試驗動物中心提供。所有動物均飼養(yǎng)于廣東省疾病預(yù)防控制中心屏障環(huán)境中，使用許可證號SCXK（粵）2013-0011，飼養(yǎng)環(huán)境條件為室溫20~26 ℃，空氣相對濕度40%~70%。

（3）儀器與試劑：CO2培養(yǎng)箱[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，HERAcell 240i]，CASY 細胞計數(shù)儀（德國Innovatis 公司，CASY-DT），酶標(biāo)儀（美谷分子儀器（上海）有限公司，SOFTmaxPRO），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，SW-CJ-2F），分光光度計（日本島津公司，UV-2550），倒置顯微鏡（上海徠卡顯微鏡有限公司，XDP-12），顯微鏡（日本OLYMPUS 公司，CX31），游標(biāo)卡尺，RPMI1640 培養(yǎng)基，綿羊紅細胞，MTT和ConA等。

1.2 試驗方法

試驗小鼠在實驗室條件下檢疫3 d 后，隨機分為4 批，每批40 只。第1 批用于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗和血清溶血素測定；第2 批用于脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗、脾淋巴細胞抗體生成試驗及NK 細胞活性試驗；第3 批用于碳廓清試驗；第4 批用于腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗。

每批動物隨機分為低、中、高3個劑量組及陰性對照組，每組10 只小鼠。低、中、高劑量分別為0.17 g/（kg BW）、0.33 g/（kg BW）、1.00 g/（kg BW）（相當(dāng)于人體日推薦量的5 倍、10 倍、30 倍），每天按0.2 mL/10 g BW 量灌胃給樣，陰性對照組灌胃同等的純凈水。給樣量根據(jù)每周體重增減調(diào)整，試驗周期為4周。

參考衛(wèi)生與健康委員會（原衛(wèi)生部）《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003 年版）[16]的方法進行臟器指數(shù)的測定、ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（MTT法）、遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)（足跖增厚法）、抗體生成細胞檢測（Jerne 改良玻片法）、血清溶血素的測定（半數(shù)溶血值法）、小鼠碳廓清實驗、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗（滴片法）、NK細胞活性測定。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠臟器指數(shù)的影響

胸腺是T 淋巴細胞分化成熟的部位，脾臟是機體內(nèi)最大的外周免疫器官[17]，免疫功能低下時胸腺、脾臟萎縮，體積變小[18]。因此，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)是表征機體免疫功能的重要指標(biāo)。由表1 可知，各劑量組小鼠的臟器/體重比值與陰性對照組比較，均無顯著性差異（P＞0.05），表明破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)無明顯影響。

表1 小鼠臟器指數(shù)測定結(jié)果（±s，n=10）

表1 小鼠臟器指數(shù)測定結(jié)果（±s，n=10）

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2.2 破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)屬于IV 型變態(tài)反應(yīng)，其組織損傷機制是由特異性致敏T 細胞所介導(dǎo)，體現(xiàn)機體的細胞免疫功能[19]。由表2 可知，與陰性對照組比較，各劑量組小鼠的足跖增厚值均升高，中、高劑量組足跖增厚值具有顯著性差異（P＜0.05），表明破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉具有促進小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的作用。

表2 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗結(jié)果（±s，n=10）

表2 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗結(jié)果（±s，n=10）

注：*表示與陰性對照組比差異顯著，P＜0.05。

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2.3 破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對ConA 誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗的影響

脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率是反映機體細胞免疫的基本指標(biāo)，通過檢測淋巴細胞轉(zhuǎn)化率可以了解試樣對機體免疫功能的影響[20]。當(dāng)T 淋巴細胞受ConA 刺激后發(fā)生增殖反應(yīng)，增殖細胞中的線粒體水解酶可將MTT（一種淡黃色的唑氮鹽）分解成紫色結(jié)晶，通過測定光密度值能反應(yīng)細胞增殖情況[16]。由表3 可知，各劑量組光密度差值與陰性對照組比較，差異均無顯著性意義（P＞0.05），表明破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力無影響。

表3 小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果（±s，n=10）

表3 小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果（±s，n=10）

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2.4 破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對血清溶血素的影響

血清溶血素是B淋巴細胞接觸紅細胞后產(chǎn)生的特異性抗體，接觸特異性抗原綿羊紅細胞后，其水平反映機體釋放特異性抗體的能力，能夠評價體液免疫功能的狀態(tài)[21]。由表4 可知，各劑量組小鼠的半數(shù)溶血值均高于陰性對照組，且中劑量組與陰性對照組的差異顯著（P＜0.05），表明破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉具有提高小鼠血清溶血素水平的作用。

表4 小鼠血清溶血素測定結(jié)果（±s，n=10）

表4 小鼠血清溶血素測定結(jié)果（±s，n=10）

注：*表示與陰性對照組相比差異顯著，P＜0.05。

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2.5 破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠脾淋巴細胞抗體生成水平的影響

抗體生成細胞由B 淋巴細胞分化產(chǎn)生，能產(chǎn)生各種免疫球蛋白，介導(dǎo)體液免疫[22]。由表5 可知，各劑量組的溶血空斑數(shù)與陰性對照組比較，差異均無顯著性（P＞0.05），表明破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠脾淋巴細胞抗體生成水平無影響。

表5 抗體生成水平測定結(jié)果（±s，n=10）

表5 抗體生成水平測定結(jié)果（±s，n=10）

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2.6 破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠碳廓清吞噬功能的影響

單核巨噬細胞吞噬能力是評價非特異性免疫功能的重要指標(biāo)，其經(jīng)典的試驗方法為碳廓清法[23]。當(dāng)印度墨汁中的顆粒狀異物注入血液后，大部分異物迅速被肝臟和脾臟中的巨噬細胞所吞噬。碳廓清試驗中測得的碳廓清指數(shù)可以反映碳粒的清除速率，吞噬系數(shù)反映的是每單位量的組織吞噬活性[24]。由表6可知，各劑量組的碳廓清吞噬指數(shù)均高于陰性對照組，且中、高劑量與陰性對照組有顯著性差異（P＜0.05），表明破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉具有促進小鼠的單核-巨噬細胞碳廓清功能的作用。

表6 小鼠碳廓清試驗結(jié)果（±s，n=10）

表6 小鼠碳廓清試驗結(jié)果（±s，n=10）

注：*表示與陰性對照組相比差異顯著，P＜0.05。

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2.7 破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞功能的影響

巨噬細胞具有很強的吞噬殺傷能力，是參與機體非特異性免疫防御的重要免疫細胞，巨噬細胞最突出的作用是清除受傷后的組織碎片和發(fā)育過程中的凋亡細胞，消滅入侵的病原體，是機體免疫保護機制之一[25]。利用巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗可以在體外觀察巨噬細胞的吞噬功能。由表7 可知，各劑量組小鼠的腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬百分率轉(zhuǎn)換值及吞噬指數(shù)指標(biāo)與陰性對照組比較，均無顯著性差異（P＞0.05），表明破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力無影響。

表7 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗結(jié)果（±s，n=10）

表7 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗結(jié)果（±s，n=10）

注：吞噬百分率轉(zhuǎn)換值X=Sin-1（p）1/2。

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2.8 破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠NK 細胞活性的影響

NK 細胞是機體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有免疫清除和免疫監(jiān)視的功能。只有活化的NK 細胞才能擴散、浸潤至感染源，故NK 細胞活性是評價機體免疫力的重要指標(biāo)[26]。由表8 可知，各劑量組小鼠的NK 細胞活性與陰性對照組比較，均無顯著性差異（P＞0.05），表明破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠NK細胞活性無影響。

表8 小鼠NK細胞活性試驗結(jié)果（±s，n=10）

表8 小鼠NK細胞活性試驗結(jié)果（±s，n=10）

注：NK細胞活性轉(zhuǎn)換值X=Sin-1（p）1/2。

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3 小結(jié)與討論

采用遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗、脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗、血清溶血素測定、脾淋巴細胞抗體生成試驗、碳廓清試驗、腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗、NK 細胞活性測定等，研究破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉的增強免疫力作用。結(jié)果表明，破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉可增強小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，提高血清溶血素半數(shù)溶血值及碳廓清吞噬指數(shù)。由此可判定，破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉可顯著增強細胞免疫功能及單核-巨噬細胞吞噬功能，具有明確的增強免疫力作用。