L-色氨酸-Hg2+-青霉胺體系的熒光光譜及分析應用

閆晶晶， 張甜， 胡詠梅， 李政， 劉劍雄， 胡小莉

1.西南大學 化學化工學院，重慶 400715；2.成都市第二人民醫院，成都 610017

青霉胺(3，3-二甲基半胱氨酸，PA)是青霉素的代謝產物，也是一種含巰基氨基酸[1].同時青霉胺也是一種具有藥理作用的手性化合物，用于治療多種疾病，如威爾遜氏病、類風濕性關節炎、硬皮病及重金屬中毒等[2].青霉胺作為手性化合物，存在D-青霉胺(D-PA)和L-青霉胺兩種對映異構體，它們的藥效及毒理作用差別很大，其中L-PA有一定毒副作用，只有D-PA有治療疾病的作用.世界衛生組織已經將D-PA列為基礎醫療中的必備藥品.因此，建立簡單、快速、高靈敏、高選擇檢測D-PA的方法具有重要意義.目前報道的檢測D-PA的主要方法有電化學發光[3]、電化學法[4]、分光光度法[5]、HPLC法[6]、圓二色性法[7]和離子色譜法[8].此外，熒光光譜法相比于其他方法更簡單、高效，且靈敏度更高.近年來，已有較多測定D-PA的熒光法報道[9-11]，但是有的熒光探針合成步驟復雜繁瑣，限制了方法的使用.本研究利用一種簡單易得的熒光探針來檢測D-PA.研究發現，L-色氨酸(L-Trp)在352 nm處有很強的熒光發射峰，隨著Hg2+的加入，L-Trp熒光被猝滅.接著加入D-PA，L-Trp的熒光得到恢復，據此建立了一種“開-關”模型來檢測D-PA，其反應機理見圖1.

圖1 L-Trp測定D-PA的反應機理

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與材料

Hitachi F-2500型熒光分光光度計(日立科學儀器有限公司，日本)；UV-2450型紫外-可見分光光度計(島津公司，日本)；pHSJ-4F酸度計(上海儀電科學儀器股份有限公司，上海).

L-Trp、D-PA(阿拉丁試劑有限公司，上海)；HgCl2(四川科倫醫藥貿易有限公司，成都)；Britton-Robinson緩沖溶液：2.71 mL 85% 磷酸(重慶北碚化學試劑廠，重慶)，2.36 mL 冰醋酸(重慶川東化工有限公司，重慶)和2.47 g 硼酸(重慶北碚化學試劑廠，重慶)溶于1.0 L蒸餾水中，用0.2 mol/L NaOH調節不同pH值.實驗過程中所用水均為超純水.

1.2 實驗方法

在10.0 mL的比色管中依次加入pH=4.8的BR緩沖溶液1.0 mL，0.5 mL 4.0 × 10-4mol/L L-色氨酸，0.5 mL 1.0 × 10-2mol/L Hg2+和一系列不同濃度的D-PA，用蒸餾水定容至刻度后搖勻，在室溫下靜置15 min.在熒光分光光度計上以λex=275 nm激發，進行波長掃描，記錄體系的熒光光譜，并在波長352 nm處測定樣品和試劑空白的熒光強度，ΔF=F-F0.狹縫寬度為10 nm.

2 結果與討論

2.1 熒光光譜

以最大激發波長275 nm對L-Trp溶液進行熒光光譜掃描，發現其最大熒光峰位于352 nm處(圖2中曲線1)，而Hg2+和D-PA均無熒光.L-Trp與D-PA溶液混合，L-Trp的熒光強度幾乎沒有變化(圖2中曲線2).然而，在一定濃度的L-Trp中加入適量Hg2+后，由于Hg2+與L-Trp 結構中的羧基結合，使得L-Trp在352 nm的熒光猝滅[12](圖2中曲線4)，接著向溶液中加入與Hg2+結合能力更強的D-PA，L-Trp被釋放出來，溶液熒光逐漸得到恢復(圖2中曲線3).

1.L-Trp；2.L-Trp+D-PA；3.L-Trp+Hg2++D-PA；4.L-Trp+Hg2+；cL-Trp=2.0×10-5 mol/L； mol/L；cD-PA=5.0×10-5 mol/L；pH=4.8.

2.2 反應條件優化

2.2.1 pH值的影響

實驗探究了不同pH值的BR緩沖溶液對反應體系的影響.由圖3可知，L-Trp-Hg2+和L-Trp-Hg2+-D-PA兩個反應體系的熒光強度在pH=2.0～3.1范圍逐漸增強，pH=3.1～7.2之間熒光逐漸減弱，但熒光恢復值(ΔF)在pH=4.0～5.0時最大(圖3插圖).因此本實驗選用pH=4.8的BR溶液為反應介質.

a.cD-PA=2.0×10-5 mol/L；b.cD-PA=0.

2.2.2 Hg2+濃度的影響

L-Trp作為一種常見天然氨基酸，已有文獻報道Hg2+可以與羧基螯合從而猝滅L-Trp的熒光[13].如圖4所示，在Hg2+濃度為4.0×10-4mol/L時，L-Trp熒光猝滅程度最大，且隨著Hg2+繼續加入，熒光強度保持不變.故本實驗選擇5.0×10-4mol/L為Hg2+后續實驗濃度.

cL-Trp=2.0×10-5 mol/L；pH=4.8.

2.2.3 離子強度和反應時間的影響

研究了離子強度對三元反應體系的影響(圖5)，當NaCl濃度低于4.0×10-4mol/L時，反應體系熒光強度較穩定；當NaCl濃度高于4.0×10-4mol/L時，熒光強度有所增加，因此，在實際樣品檢測過程中要注意控制離子強度，避免高濃度鹽類的引入.此外，實驗發現L-Trp的熒光在15 min恢復到最大值并且在1 h內保持穩定，因此選擇15 min為反應時間.

cL-Trp=2.0×10-5 mol/L， mol/L，cD-PA=5.0×10-5 mol/L，pH=4.8.

2.3 方法的選擇性

為了考察該方法的選擇性，在優化的實驗條件下，探究了20種常見物質對測定D-PA的影響.當共存物質引起的熒光強度改變在相對誤差±5%之內，通常認為不會對檢測造成影響.由表1可知，常見的金屬離子、氨基酸、糖類對D-PA的檢測幾乎沒有影響，表明本法具有較好的選擇性，可以應用于實際樣品的檢測.

表1 共存物質的影響(cD-PA=5.0×10-5 mol/L)

2.4 標準曲線

按照前述實驗方法，測定不同D-PA濃度下反應體系的熒光強度.如圖6所示，隨著D-PA的加入，L-Trp的熒光逐漸恢復，熒光恢復程度(ΔF)與D-PA濃度在0.44～50.0 μmol/L范圍內呈現良好的線性關系(圖6插圖)，線性回歸方程為ΔF=226.6C+51.8，相關系數為0.999 3，檢出限(3σ/K)達0.13 μmol/L.表2列出了本法與其他方法測定D-PA的比較，由此可以看出，本法靈敏度高，操作簡單，更具有實用價值.

cL-Trp=2.0×10-5 mol/L， mol/L，cD-PA×10-5 mol/L/a-f=0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0.

表2 測定D-PA的不同方法的比較

2.5 邏輯門的模擬應用

分子傳感器與目標分析物協同作用，對反應條件進行信息處理，將一個或多個反應條件作為輸入信號，熒光信號的改變作為輸出信號[14].基于熒光響應可以通過Hg2+和D-PA的加入來回切換，體系熒光強度進入“on-off-on”模式，為此構建了IMPLICATION邏輯門[15].以 L-Trp作為一種邏輯門裝置，設定Hg2+(輸入1)和D-PA(輸入2)為輸入信號，352 nm處熒光強度為輸出信號，0和1分別代表熒光猝滅和未猝滅.無信號輸入(0，0)或只有D-PA輸入(0，1)，352 nm處熒光吸收很強，輸出為1；單獨Hg2+輸入(0，1)時，熒光猝滅，輸出為0.當兩者同時輸入(1，1)時，L-Trp熒光恢復，輸出為1.表3為邏輯門對應的真值表，圖7為熒光輸出IMPLICATION邏輯圖.

表3 邏輯門真值表

圖7 IMPLICATION邏輯圖

2.6 實際樣品的測定

為了評價本方法的適用性和有效性，將本方法用于青霉胺藥片中D-PA含量檢測.隨機選10片藥片(上海信誼藥廠有限公司)，研細.稱取相當于0.25片質量的樣品，溶解、過濾、除去不溶物，最后定容至500.0 mL容量瓶中，備用.吸取0.5 mL待測液于10.0 mL比色管中進行檢測，結果見表4.通過標準加入法測得回收率和相對標準偏差分別為96.0%～103.8% 和2.8%～4.0%，表明本方法具有較高的準確度和較好的重復性，可以用于實際樣品的測定.

表4 藥片中D-PA的測定結果

3 結論

利用Hg2+與D-PA之間的強螯合作用，使得Hg2+脫離L-Trp，L-Trp熒光得到恢復，從而設計了分子邏輯門，并建立了D-PA的熒光檢測新方法.本方法相較于其他方法，簡單易行、選擇性好、靈敏度高，無需精密的儀器和復雜的合成步驟，適用于青霉胺藥片含量的測定.