結核感染T細胞斑點試驗聯合胸腔積液腺苷脫氨酶檢測對胸腔積液患者中活動性肺結核病的早期診斷及療效評估價值

曹雯雯，劉 欣，楊 陽

結核病是一種慢性傳染性疾病，是由結核分枝桿菌感染引起，致死率較高。據世界衛生組織報道，每年有1 000萬結核病新發病例，且近年來發病率持續上升[1]。我國是結核病高發區，發病人數在世界范圍內排名靠前，嚴重威脅人類生命健康安全。臨床上可將結核病分為活動性結核和潛伏性結核[2]?；顒有苑谓Y核初期患者主要有發熱、咯痰等癥狀，臨床特征并不明顯，容易導致誤診。當出現咳嗽、咯血等特征時患者已進入中晚期，如無法及時診斷肺結核，可能會延誤結核病的最佳治療時機。因此，如何早期發現潛在的活動性肺結核患者是結核病防治的重點[3]。結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）是以T細胞免疫應答作為基礎的γ干擾素釋放試驗，用于結核分枝桿菌的檢測和結核病的輔助診斷[4]。胸腔積液生化指標檢測對肺結核患者的明確診斷具有至關重要的作用，其腺苷脫氨酶（ADA）作為鑒別結核性與惡性胸腔積液重要指標之一，是目前性價比較高的診斷手段[5]。單一指標診斷活動性肺結核的準確度較低，且存在標本污染等問題，因此，尋找靈敏度、特異度、準確度較高的生物學標志物對活動性結核的診斷具有重要臨床價值。蔣鵬[6]研究發現聯合檢測ADA和乳酸脫氫酶（LDH）對結核性胸腔積液具有較高診斷價值，本研究擬探討T-SPOT.TB聯合胸腔積液ADA檢測對活動性肺結核患者的診斷價值，以期尋找契合度和準確度高的診斷 方案。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月—2018年6月在山東第一醫科大學第二附屬醫院（原泰山醫學院附屬醫院）就診的有肺部病灶伴胸腔積液患者201例，患者年齡在30～70歲，平均（46.5±8.7）歲，其中男136例，女65例?；颊呷朐汉缶洺暋⒂嬎銠C斷層攝影（CT）檢查證實存在胸腔積液。所有患者均經影像學檢查、痰結核分枝桿菌DNA、痰涂片檢查進行診斷，根據診斷結果將患者分為活動性肺結核組（76例）和非結核組（125例）。本研究經醫學倫理委員會審核批準，入選人員對研究內容完全了解，所有患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 活動性肺結核診斷標準[7]

①X線檢查肺部有空洞、增殖性病變、滲出性病變、干酪性病變；②病原菌陽性患者，正在治療且未完成規定療程的患者；③病原菌陰性患者，抗結核治療＜3個月，或病原菌陽性患者，中斷治療＜2個月，初治者治療＜5個月，復治者治療＜6個月。此次痰結核菌檢查陰性，且符合上述情況之一者為活動性肺結核。

1.3 研究方法

外周血T-SPOT.TB檢測：檢測工具采用酶聯免疫斑點的配套儀器，于患者入院后第2天清晨，無需空腹，采取6～8 mL外周全血，用肝素鈉抗凝處理，保存于18～25℃，24 h內采用T-SPOT.TB試劑盒（英國Oxford Immunotec公司）完成檢測。TB-Ab檢測：應用免疫金標本技術檢測血清中結核分枝桿菌IgG抗體。結核菌素（PPD）試驗：取0.1 mL結核菌素稀釋液，于患者左前臂掌側中下部1/3交界處予以皮內注射，形成6～10 mm大小的皮丘；2～3 d后測量形成的硬結直徑，判斷診斷結果。試驗前需向患者說明試驗原理并征求其同意。

取每例患者治療前首次獲得的胸腔積液60 mL，其中將10 mL胸腔積液分別置于2個肝素抗凝管中，采用全自動生化分析儀（美國Beckman公司）檢測其總蛋白水平；LDH、ADA試劑盒（美國羅氏公司）分別檢測其LDH、ADA水平；另外50 mL胸腔積液中加入0.2 mL的2 500 U肝素抗凝，采用T-SPOT.TB試劑盒檢測T-SPOT.TB水平。嚴格按照試劑盒說明書步驟檢測。

T-SPOT.TB檢測步驟：①胸腔積液T-SPOT.TB的檢測，胸腔積液經700×g離心7 min后去除上清液，RPMI 1640細胞培養液重懸沉淀物，采用Ficoll淋巴細胞分離液分離出單個核細胞；按照說明書，每個患者樣本設置4個檢測孔，在包被有小鼠抗人γ干擾素單抗的微孔培養板的4個檢測孔中分別加入細胞培養液（陰性對照孔）、早期分泌靶向抗原6（抗原A）、培養濾過蛋白10（抗原B）和植物血凝素（陽性對照孔）；將制備的單個核細胞分別加入到上述4孔中，加細胞終止液孵育16～20 h；棄去細胞液，PBS洗滌，加經PBS稀釋的酶標抗體工作液孵育1 h，棄去酶標抗體工作液，加底物顯色溶液顯色；去離子水洗滌培養板終止反應，晾干后采用酶聯斑點分析儀觀察每孔斑點數（細胞數）。②外周血T-SPOT.TB的檢測，外周血置于肝素鈉抗凝管中混勻后與RPMI 1640細胞培養液1∶1混勻，加在Ficoll淋巴細胞分離液上層，離心分離出單個核細胞，后續操作步驟同胸腔積液T-SPOT.TB的檢測。陽性結果判定[8]：檢測孔斑點數－陰性對照孔斑點數（0～5個）≥6為陽性；檢測孔斑點數＞2×陰性對照孔斑點數（≥6個）為陽性；實驗結果中陽性質控均正常（陽性對照孔斑點數≥20個）；不符合上述陽性標準且陽性質控正常時為陰性。

1.4 統計學分析

數據分析采用SPSS 25.0軟件，偏態分布的計量資料采用中位數（范圍）表示。 以頻數形式表示計量資料，組間比較采用χ2檢驗，Pearson相關性方法分析T-SPOT.TB及胸腔積液ADA相關生化指標間的相關性，P＜0.05表示差異有統計學意義。結合臨床，將單因素分析差異有統計學意義 （P＜0.05）的變量納入多因素logistic回歸模型，以建立預測模型。將多因素分析中P＜0.001的獨立危險因素納入療效評估模型。將胸腔積液總蛋白＞30.91 g/L、胸腔積液ADA＞31.65 U/L、PPD試驗陰性、TB-Ab檢測陰性、T-SPOT.TB陽性、肝功能不全、結核接觸史的患者各予以賦1分，得分＞5為高風險組，＞2～5分為中風險組，≤2分為低風險組。最終分值越高，則風險越高[9]。受試者工作特征（ROC）曲線分析模型對活動性肺結核患者的預測價值，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料比較

兩組患者一般臨床資料比較顯示：對比活動性肺結核組和非結核組性別、年齡、BMI等基本資料差異均無統計學意義（P＞0.05），說明分組在后續的指標中具有可比性。兩組患者球蛋白、肌酐、吸煙史、糖尿病史、總膽紅素、細菌感染、支氣管擴張、哮喘、實體瘤和血管炎比較差異無統計學意義（P＞0.05）。兩組患者結核接觸史、乙型肝炎、肝功能不全和結節性紅斑相比，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 兩組患者一般臨床資料比較Table 1 Patient characteristics compared between patients with active tuberculosis and those without tuberculosis

2.2 兩組患者T-SPOT.TB和胸腔積液ADA相關生化指標的比較

活動性肺結核組胸腔積液總蛋白、胸腔積液ADA和胸腔積液LDH水平均高于非結核組，且兩組患者在TB-Ab檢測陰性、外周血T-SPOT.TB陽性、胸腔積液T-SPOT.TB陽性、胸腔積液總蛋白、胸腔積液ADA（P＜0.01），PPD試驗陰性和胸腔積液LDH（P＜0.05）中比較差異均有統計學意義。見表2。

表2 T-SPOT.TB和胸腔積液ADA相關生化指標的相關性分析Table 2 Correlation analysis between tuberculosis assays and relevant biomarkers and T-SPOT.TB test in pleural effusion

2.3 影響因素分析

根據本院201例患者的一般資料進行多因素分析，將單因素分析差異有統計學意義的變量納入分析，發生活動性肺結核為因變量，建立預測模型。結果發現胸腔積液總蛋白、胸腔積液ADA、PPD試驗陰性、TB-Ab檢測陰性、外周血T-SPOT.TB陽性、胸腔積液T-SPOT.TB陽性、肝功能不全、結核接觸史為活動性肺結核發生的獨立危險因素。見圖1。

2.4 相關性分析

Pearson相關分析顯示，PPD試驗陰性、TB-Ab檢測陰性、外周血T-SPOT.TB陽性分別與生化指標胸腔積液總蛋白、胸腔積液ADA、胸腔積液T-SPOT.TB呈正相關（P＜0.05或P＜0.01）。

2.5 診斷價值

ROC曲線分析表明：胸腔積液T-SPOT.TB、外周血T-SPOT.TB和胸腔積液ADA最佳臨界值分別為276.43×106/mL、39.68×106/mL和45.36 U/L，ROC曲線AUC分別為0.712、0.698和0.669，且靈敏度分別為75.31%、72.93%和67.12%，特異度分別為73.64%、71.62%和62.09%，具有診斷價值。胸腔積液T-SPOT.TB、ADA聯合預測活動性肺結核病與外周血T-SPOT.TB、胸腔積液ADA聯合預測時AUC分別為0.826與0.811 （P＜0.001），靈敏度分別為83.49%與80.62%，特異度分別為70.36%與67.24%，均較三者單獨預測時明顯增加（P＜0.05），說明聯合診斷價值更高。見圖2。

2.6 建立活動性肺結核風險評估模型

將獨立危險因素納入構建中高?；顒有苑谓Y核患者風險評分模型，得分＞5為高風險組，＞2～5分為中風險組，≤2分為低風險組。見圖3。

2.7 分析模型效能

療效評估模型的評價：ROC曲線顯示，曲線AUC=0.837，95%CI：0.751～0.897，診斷靈敏度和特異度分別為84.00%和69.37%，結果提示該評估模型對活動性肺結核患者具有較好的預測價值，見圖4。

3 討論

結核病是一種慢性傳染病，全世界每年估計有近180萬與結核病相關患者死亡[10]。從全球結核病疫情控制情況來看，中國是主要的結核病高負擔國家。我國活動性肺結核患者每年死亡人數約5萬，且近年發病率持續增高[11]。結核病可累及全身各個系統，臨床表現多樣且不典型，在臨床上的診斷較為困難，誤診率較高。我國是結核病高發區，如何對患者進行及早有效的診斷是目前臨床上亟待解決的問題。痰培養、影像學檢查、PPD試驗及臨床表現是當前臨床上綜合判斷結核病的方法，但PPD試驗及痰培養在常規接種卡介苗國家的診斷特異度和靈敏度較低[12]。影像學檢查和臨床表現是診斷結核病的輔助手段，但無法確診，因此尋找早期診斷活動性肺結核的快速、準確方法至關重要。目前診斷方法較多，但每種診斷方法均有不一樣的特異度和靈敏度。T-SPOT.TB、PPD試驗、胸腔積液ADA等均是臨床常用于檢測結核病的方法[13-15]。據此，本研究探討聯合T-SPOT.TB和胸腔積液ADA對活動性肺結核患者的診斷價值，為臨床上早期發現、早期診斷及療效評估提供更客觀科學的依據。

T-SPOT.TB是近年來興起的檢測結核分枝桿菌感染的新技術，對結核感染診斷具有較高的靈敏度和特異度。張群[16]研究發現T-SPOT.TB在不同人群中的靈敏度和特異度波動較大，若將其作為診斷結核病的排除性標準，會導致T-SPOT.TB低敏感性人群的結核病漏診率大大增加；有研究表明活動性肺結核患者胸腔積液ADA水平高于非結核患者，ADA的測定是目前性價比較高的診斷手段[17]，所以考慮兩者聯合提高患者診斷率。本研究回顧性分析患者臨床資料，發現活動性肺結核組和非結核組性別、年齡、BMI、球蛋白、肌酐、吸煙史、糖尿病史、總膽紅素、細菌感染、支氣管擴張、哮喘、實體瘤和血管炎等比較差異無統計學意義，結核接觸史、乙型肝炎、肝功能不全和結節性紅斑的差異有統計學意義。PPD試驗是臨床上診斷結核分枝桿菌的傳統措施，可檢測出卡介苗及環境中的分枝桿菌，是通過利用多種抗原混合物進行檢測。TB-Ab檢測可反映出肺結核患者機體生化及體液免疫方面的改變[15]。胸腔積液是一種常見臨床癥狀，多由胸膜、肺、多種肺外疾病、感染所致，目前臨床上已開展的檢測項目包括胸腔積液ADA、LDH、腫瘤標志物癌胚抗原和總蛋白等檢測，有助于結核病的鑒別和診斷[6]。 本研究中活動性肺結核組患者胸腔積液總蛋白、ADA和LDH水平均高于非結核組，且活動性肺結核TB-Ab檢測陰性、外周血T-SPOT.TB陽性、胸腔積液T-SPOT.TB陽性、PPD試驗陰性患者比例均大于非結核組，與蔣鵬[6]、 景淑賢等[18]研究結果相一致。在此基礎上研究T-SPOT.TB與胸腔積液ADA相關生化指標的相關性，發現TB-Ab檢測陰性、PPD試驗陰性、T-SPOT.TB陽性分別與胸腔積液總蛋白、胸腔積液ADA、胸腔積液T-SPOT.TB呈正相關。ROC曲線分析驗證了胸腔積液T-SPOT.TB聯合胸腔積液ADA、外周血T-SPOT.TB聯合胸腔積液ADA的AUC分別為0.826、0.811，均較胸腔積液T-SPOT.TB、ADA、外周血T-SPOT.TB單獨預測的AUC明顯增加，提示聯合具有更高的診斷價值。

諸多研究表明年齡、結核接觸史、吸煙史等是導致活動性肺結核發生的危險因素[19-20]。本研究將單因素分析差異有統計學意義的變量納入分析，結果發現胸腔積液總蛋白、胸腔積液ADA、PPD試驗陰性、TB-Ab檢測陰性、外周血T-SPOT.TB陽性、胸腔積液T-SPOT.TB陽性、肝功能不全、結核接觸史為活動性肺結核發生的獨立危險因素。近年來，用于預測肺結核療效的評分系統、灰色預測模型、BP神經網絡模型等應用逐漸廣泛[21]。 但在活動性肺結核患者中仍缺乏一個良好的療效評估模型，本研究結合logistic多因素分析的獨立危險因素構建療效評估模型，ROC曲線結果表明AUC=0.837，95%CI：0.751～0.897，診斷靈敏度為84.00%，特異度為69.37%，說明該模型具有較好的效能和一致性的預測價值。

綜上所述，T-SPOT.TB聯合胸腔積液ADA對活動性肺結核患者具有較好的診斷及鑒別診斷價值，構建基于T-SPOT.TB聯合胸腔積液ADA與其他危險因素的療效評估模型，可提高有效預測患者發生活動性肺結核水平，協助臨床醫師對活動性肺結核患者采取有效的治療決策。