小鼠炎癥性腸病合并艱難梭菌感染模型的建立與評價

王 莉，周芬芬，胥 騰，吳 湜，李靜文，黃海輝

艱難梭菌是引起醫院獲得性腹瀉的重要病原體，也是炎癥性腸病（IBD）加重或反復的危險因素。多項研究顯示IBD亦是艱難梭菌感染（CDI）的一項獨立危險因素[1]。近年來，IBD合并CDI的發病率上升，病情嚴重，急性結腸切除率和死亡率均增高[2-3]。然而，IBD患者合并CDI發病機制尚不明確，構建能反映疾病特點的動物模型對進一步研究十分必要。

最初國外研究者采用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導小鼠結腸炎，繼而腹腔注射克林霉素以誘導CDI來建立IBD急性期合并CDI模型[4]。由于部分IBD患者是在緩解期出現CDI[5-6]，因而又有研究者先通過給予小鼠DSS誘導結腸炎，之后小鼠度過一段恢復期，然后再給小鼠飲用抗生素混合液及腹腔注射克林霉素以誘導CDI來建立IBD合并CDI模型[5]。然而由于頭孢哌酮抗菌譜廣，安全性好，因此近年來臨床上IBD患者應用克林霉素的機率遠低于頭孢哌酮，既往很多動物研究也顯示頭孢哌酮的干預有利于艱難梭菌的定植[7-9]。但是頭孢哌酮腹腔注射給藥對誘導小鼠艱難梭菌定植特點未見報道，為此，本研究擬分別采用腹腔注射克林霉素或頭孢哌酮誘導CDI，以探索建立更符合臨床過程的IBD急性期和恢復期小鼠合并CDI模型的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株和細胞 艱難梭菌菌株SW2007H1（核糖體型027菌株），由瑞典卡羅林斯卡醫學院惠贈。Vero 細胞（目錄號：SCSP-520）購自中國科學院細胞庫，用于糞便毒素檢測實驗。

1.1.2 實驗動物 野生型C57BL/6小鼠，雌性，6～8周齡，16～19 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于中國科學院上海巴斯德研究所ASBL2動物房。所有實驗與操作均符合動物倫理規范與要求（倫理批號：2020069）。

1.1.3 抗菌藥物 克林霉素、頭孢哌酮等抗菌藥物均購于大連美侖生物科技有限公司。抗菌藥物混合液由45 mg/L萬古霉素、35 mg/L黏菌素、 35 mg/L慶大霉素和215 mg/L甲硝唑溶于無菌水中，0.22 μm過濾后備用。

1.1.4 主要試劑和培養基 DSS為美國MP Biomedicals公司產品。心腦浸液瓊脂及肉湯、酵母提取物為英國OXOID公司產品。

1.2 方法

1.2.1 艱難梭菌芽孢制備 將1株艱難梭菌（核糖核酸型027）從－80℃冰箱取出，接種于含添加劑的心腦浸液（BHIS）平板上，厭氧培養48 h后，挑取單菌落至BHIS肉湯中，過夜增菌，將菌液涂布于BHIS平板上。厭氧培養約1周后，顯微鏡下觀察菌體全部變為芽孢后，6 000 r/min離心10 min，留取沉淀，用無菌PBS洗滌2～3次，用PBS重懸，65℃加熱30 min以殺死營養細胞。將菌液10倍系列稀釋涂布于BHIS平板上，進行芽孢計數，制備106CFU/mL的芽孢懸液，4℃保存。

1.2.2 模型建立與分組 將小鼠分為IBD急性期合并CDI和IBD恢復期合并CDI 2大組，每個大組再根據腹腔注射克林霉素或頭孢哌酮分為2小組，共4組，每組8只鼠，另設1組健康對照組，不作任何處理。所有時間計算都以24 h計。IBD急性期合并CDI組先給予3%DSS飲用水5 d（Day0～Day5），后換成正常飲用水，于第6天分別腹腔注射1劑10 mg/kg克林霉素或100 mg/kg頭孢哌酮，于第7天每只小鼠灌胃105CFU艱難梭菌芽孢（即100 μL 含 106CFU/mL芽孢PBS混懸液）；IBD恢復期合并CDI組先給予2%DSS飲用水6 d （Day0～Day6），后換成正常飲用水15 d，再給抗生素混合液3 d（Day21～Day24），再改為正常飲用水，于第26天分別腹腔注射1劑10 mg/kg 克林霉素或100 mg/kg頭孢哌酮，于第27天每只小鼠灌胃105CFU艱難梭菌芽孢（即100 μL 含 106CFU/mL芽孢PBS混懸液）。上述各組小鼠均觀察至第34天，小鼠處于瀕死狀態將被處死[4]，感染組實驗設計見圖1。

1.2.3 觀察指標 ①小鼠的體重變化。②小鼠疾病活動度指數（disease activity index，DAI）評分[4]：根據體重，將下降＜5%、5%～10%、11%～15%、16%～20%、＞20%依次評為0、1、2、3、4分；糞便性狀為成形、柔軟、腹瀉、中度腹瀉和全腹瀉，分別評為0、1、2、3、4分；根據便血程度評分，無便血為0分，微紅色為2分，血便為3分，全血便為4分；總分為12分。③小鼠生存率：體重下降＞初始體重20%認定為瀕死狀態，將被處死，與實際死亡的小鼠共同計算死亡率。④病理觀察：小鼠疾病高峰期時取結腸做病理分析，采用4%多聚甲醛固定、切片、HE染色。根據炎癥程度、隱窩破壞和潰瘍情況3方面評分，共11分[4]。

1.2.4 檢測糞便中細胞毒素 給予艱難梭菌灌胃48 h后（Day2或Day3），收集小鼠糞便。將收集的小鼠糞便或腸道內容物樣本溶于10倍質量體積的無菌PBS中混勻后，4℃ 15 000 r/min 離心 5 min，取上清液作系列稀釋，加入至單層Vero細胞中，放置在5% CO2孵箱中，37℃培養，觀察若超過80%細胞變圓則為毒素陽性[10]。若糞便毒素陽性且小鼠出現相應艱難梭菌感染癥狀，如弓背、體重下降、腹瀉等癥狀，則表明感染成功。

1.2.5 菌株鑒定 糞便樣本采用Cepheid公司的Xpert?C. difficileAssay 艱難梭菌核酸檢測試劑盒驗證是否為tcdC基因突變艱難梭菌，如檢測陽性則提示致病菌為027型可能大。

1.2.6 統計學方法 采用GraphPad 8.0進行所有數據的統計分析，采用Kaplan-Meier曲線進行生存分析，實驗數據用均數±標準誤差表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成功建立小鼠IBD合并CDI模型

4組小鼠均出現腹瀉和體重下降癥狀，同時糞便毒素檢測陽性，糞便艱難梭菌tcdC突變陽性，病理顯示結腸出現炎性滲出、隱窩破壞和局灶潰瘍，因此建模成功。

2.2 小鼠體重變化和DAI評分

2.2.1 急性期組 在感染艱難梭菌后，克林霉素組和頭孢哌酮組小鼠均出現體重下降，其中克林霉素組在感染艱難梭菌第3天體重下降最嚴重，后呈回升趨勢，頭孢哌酮組主要在第1、2天體重下降，后迅速恢復。克林霉素組體重下降程度較頭孢哌酮組更為明顯，體重回升相對較慢。克林霉素組小鼠DAI評分在感染后第3天最高，頭孢哌酮組在第1、2天較高，感染后克林霉素組小鼠DAI評分均高于頭孢哌酮組，自第3天起兩組DAI評分差異有統計學意義，見圖2A、2B。

2.2.2 恢復期組 在感染前，因給小鼠飲用DSS水溶液誘導輕中度腹瀉，小鼠于第8、9天體重下降最為明顯，后逐漸回升至正常水平，克林霉素組和頭孢哌酮組體重變化相似。在感染后，克林霉素組體重逐漸下降，至第3天下降至最低并全部死亡，頭孢哌酮組于第1、2天下降明顯但程度較輕，第3天迅速回升。克林霉素組體重下降程度較頭孢哌酮組更為明顯。克林霉素組DAI評分較頭孢哌酮組為高，在第2、3天差異有統計學意義，頭孢哌酮組DAI評分于第4天降低至近0，見圖2C和2D。

2.3 小鼠生存率

2.3.1 急性期組 克林霉素組小鼠生存率為25.0%（2/8），死亡主要集中在艱難梭菌芽孢感染后第2、3天，與對照組生存率有顯著差異。頭孢哌酮組小鼠生存率為62.5%（5/8），死亡主要集中在感染后第1、2天，但與對照組差異無統計學意義，見圖3A。

2.3.2 恢復期組 在感染后，克林霉素組小鼠在第2、3天相繼全部死亡。頭孢哌酮組小鼠只在第2天出現1只死亡，生存率為87.5%（7/8），生存率明顯高于克林霉素組，差異顯著，但與對照組差異無統計學意義，見圖3B。

2.4 小鼠組織病理學變化

與健康對照組相比，4組感染組小鼠結腸均出現不同程度的炎性滲出。急性期克林霉素組出現炎性細胞向黏膜下層浸潤，隱窩破壞嚴重，并出現潰瘍，而急性期頭孢哌酮組炎性浸潤和隱窩破壞較前者為輕。恢復期克林霉素組也同樣出現了炎性細胞的廣泛浸潤，隱窩破壞嚴重甚至消失，伴有局灶性潰瘍，而恢復期頭孢哌酮組病理改變相對輕微。與健康對照組相比，急性期克林霉素組和頭孢哌酮組組織評分分別為7.33±0.29和5.33±2.02，恢復期克林霉素組和頭孢哌酮組評分分別為7.67±0.29和4.67±1.61，4組差異均無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

IBD被認為是由多種因素引起的黏膜免疫反應紊亂和腸道菌群失調的一種慢性腸道炎癥。艱難梭菌在宿主菌群受到破壞的情況下，產毒素菌株通過分泌毒素破壞腸道屏障，引起以腹瀉為主的一系列癥狀[11]。IBD患者對艱難梭菌的易感與IBD病情嚴重程度有關[12]。因而建立不同疾病階段的IBD合并CDI動物模型是研究二者相互作用及機制的重要平臺，為探索新的防治方案提供 參考。

很多研究采用腹腔注射克林霉素的方法建立CDI動物模型[13-14]。Tomkovich等[15]的研究顯示克林霉素干預后，小鼠的腸道菌群發生明顯變化，比如毛螺菌科、瘤胃菌科、腸桿菌科細菌豐度改變，艱難梭菌易定植。同時，也有研究通過給予小鼠飲用頭孢哌酮水溶液成功誘導CDI[8]。Theriot等[7]的研究顯示小鼠飲用頭孢哌酮水溶液后，腸道微生物組和代謝組也發生了明顯的變化，比如擬桿菌科細菌明顯減少，變形菌門細菌明顯增多；代謝物初級膽汁酸、糖醇增多，次級膽汁酸、葡萄糖、游離脂肪酸減少，為艱難梭菌易感狀態。此外，有研究對比了抗生素雞尾酒療法聯合腹腔注射克林霉素、頭孢哌酮水溶液飲用5 d和10 d 3種不同抗生素給藥方法誘導CDI，均成功建立了CDI模型[10]。但上述方法頭孢哌酮的干預方式均為配制成水溶液供小鼠自由飲用數日，但未見頭孢哌酮腹腔注射對小鼠艱難梭菌定植的影響。近年Zhou等[4]的研究首次發現DSS誘導的結腸炎小鼠感染艱難梭菌時，臨床結局較IBD和CDI單病種小鼠更差，同時IBD小鼠在有抗生素使用史的情況下，腹腔注射克林霉素后更易感染艱難梭菌。本研究對比了IBD急性期小鼠分別腹腔注射克林霉素和頭孢哌酮后的相關表型，發現克林霉素誘導CDI的小鼠疾病嚴重程度較頭孢哌酮組為重，且恢復相對較慢，更符合IBD合并CDI疾病較重的特點，也與Zhou等[4]的研究一致。Saleh等[5]研究在DSS撤去15 d后，再對小鼠按照建立CDI模型的方法給藥，該模型可更好反映臨床上IBD患者緩解期的表現。本研究同樣對比了IBD恢復期小鼠分別注射克林霉素和頭孢哌酮對誘導CDI的影響，結果顯示克林霉素誘導的小鼠疾病較重，死亡率100%，與Saleh等[5]的研究一致，而頭孢哌酮誘導的小鼠病情輕微，可能無法模擬IBD合并CDI患者情況。本研究發現IBD急性期和恢復期的小鼠感染艱難梭菌后，疾病變化過程類似，如急性期和恢復期IBD小鼠采用克林霉素誘導合并CDI時，在感染艱難梭菌后第3天疾病最為嚴重。不同的是，克林霉素誘導的恢復期組模型較急性期組病情更為嚴重，生存率更低，有研究認為這可能是結腸炎誘導產生T輔助17細胞，這些細胞在結腸炎恢復后仍存在于腸系膜淋巴結中，并在之后CDI時發揮作用，加重病情[5]。

本研究存在一定局限性：采用化學法DSS誘導結腸炎，只能模擬IBD中潰瘍性結腸炎的疾病特點，不適用于克羅恩病[16]；未對不同模型小鼠腸道菌群及代謝產物進一步分析，做機制上的 探索。

綜上所述，相較于頭孢哌酮，采用腹腔注射克林霉素的方法建立IBD急性期和恢復期小鼠合并CDI模型更為嚴重，生存率更低，因而推薦采用10 mg/kg的克林霉素腹腔注射誘導建立急性期或恢復期IBD小鼠感染艱難梭菌的模型，可反映臨床上處于不同階段的IBD合并CDI患者的特點。