多育節(jié)莢孢霉感染的微生物實驗室檢測和診療現(xiàn)狀

王星星，孟 涵，李曙光，王 啟，王 輝

多育節(jié)莢孢霉（Lomentospora prolificans）隸屬于真菌界，子囊菌門真子囊菌綱小囊菌目小囊菌科節(jié)莢孢霉屬（Lomentospora），雖然按之前分類歸類于賽多孢屬，但其在形態(tài)學和臨床特征上與賽多孢屬其他菌種并不相同[1-3]。多育節(jié)莢孢霉作為一種土壤腐生菌隨處可見，常在溫帶和熱帶地區(qū)的土壤中被分離出[4]，也在污水、腐物等受污染的環(huán)境中存在。其所引起的感染呈世界范圍內分布，主要存在于澳大利亞、美國西南部和西班牙等地區(qū)[5-7]。與其他國家相比，澳大利亞感染的發(fā)病率相對較高，可能是由于澳大利亞有利于真菌生長的氣候和環(huán)境，也有專家認為土壤pH值起了一定的作用[8]。研究顯示西班牙、美國和加拿大等國家的土壤pH值范圍與澳大利亞土壤相 似[9]，報告的病例主要來自這些地區(qū)。

多育節(jié)莢孢霉感染可累及人體的多個器官和系統(tǒng)，可引起致死性感染，常見于血液系統(tǒng)疾病和免疫功能低下人群。由于其感染所累及的器官和系統(tǒng)較多及患者免疫功能不全等因素，導致臨床表現(xiàn)較為復雜，臨床診療難度增大。現(xiàn)局限性和播散性感染病例逐年上升。播散性感染主要見于免疫功能不全患者，感染部位常累及多個部位，包括肺、腦、皮下組織等；而與創(chuàng)傷或溺水事件相關的感染通常導致局限性感染，感染以骨、關節(jié)、肺部和軟組織等為主[10-11]。1984年，Malloch 等[12]首次報道了多育節(jié)莢孢霉所致的骨髓炎，西班牙學者的研究結果顯示，血流感染的死亡率高于局限性感染[13]。回顧西班牙某醫(yī)院1990—1999年由多育節(jié)莢孢霉導致的血行播散感染中6例患者有5例死亡，而多育節(jié)莢孢霉引起的局限性感染中12例患者有6例死亡[13]。研究發(fā)現(xiàn)多育節(jié)莢孢霉對多數(shù)抗真菌藥物存在耐藥性，包括臨床常用的唑類、兩性霉素、氟胞嘧啶類等藥物[13]。西班牙學者對多育節(jié)莢孢霉感染中分離的15株多育節(jié)莢孢霉進行了體外抗真菌藥敏試驗，對氟胞嘧啶、兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、酮康唑和咪康唑等測試藥物均為耐藥，該研究中的多育節(jié)莢孢霉感染死亡率超過50%[11,13]。因此，及時診斷并搶先治療對于多育節(jié)莢孢霉感染患者的最大生存期限和預后極為重要。現(xiàn)就多育節(jié)莢孢霉的微生物實驗室檢測、鑒定和診療現(xiàn)狀作一綜述。

1 分類

真菌主要依據(jù)形態(tài)特征進行分類，分級依次是門、亞門、綱、目、科，每個科又分為若干屬，這些屬又分為不同的種。目前真菌界分為7個門，主要有子囊菌門和擔子菌門。多育節(jié)莢孢霉原是子囊菌門真子囊菌綱小囊菌目小囊菌科賽多孢屬中的一種，因其在黏液團中能產(chǎn)生伸長的環(huán)痕細胞和倒卵球形的分生孢子，故早期被稱作多育賽多孢霉（Scedosporium prolificans）。然而，分子研究證明多育節(jié)莢孢霉與賽多孢屬親緣關系相距甚遠，故被重新分類于節(jié)莢孢霉屬[14]，更名為多育節(jié)莢孢霉。多育節(jié)莢孢霉是節(jié)莢孢霉屬中唯一可引起人類致病的菌種，其感染呈世界性分布，但各地分離的多育節(jié)莢孢霉在生態(tài)學、耐藥性和臨床特征等方面也存在差異[13,15]。

2 微生物實驗室檢測

2.1 真菌培養(yǎng)

微生物實驗室常規(guī)方法是通過真菌培養(yǎng)來鑒定多育節(jié)莢孢霉，多育節(jié)莢孢霉在普通培養(yǎng)基上均可生長，但因多育節(jié)莢孢霉不能耐受放線菌酮（環(huán)己酰亞胺），培養(yǎng)基中如含有放線菌酮將會抑制多育節(jié)莢孢霉的生長甚至不生長[13]，因此，許多真菌學領域的學者建議選用半選擇性培養(yǎng)基或選擇性培養(yǎng)基對多育節(jié)莢孢霉進行培養(yǎng)，因為這類培養(yǎng)基可以抑制曲霉等的生長[15]。這類培養(yǎng)基包括Scedosporium Selective agar (SceSel+)及 其Scedo-Select Ⅲ，培養(yǎng)基中包含苯異甲基和氯硝銨[16-17]，Blyth等[18]和Sedlacek等[19]大多數(shù)學者通過研究建議將非選擇性培養(yǎng)基如SDA和選擇性培養(yǎng)基聯(lián)合使用，選擇性培養(yǎng)基最好選SceSel+或DRBC，但微生物真菌培養(yǎng)工作選擇SDA和SCDA聯(lián)合使用，即可滿足培養(yǎng)需求。

2.2 形態(tài)學

多育節(jié)莢孢霉生長速度較其他絲狀真菌稍慢，且缺乏氣生菌絲，所以如同時有快生長的絲狀真菌（如曲霉等）常會掩蓋多育節(jié)莢孢霉的生長，而導致漏檢。多育節(jié)莢孢霉在平板上菌落形態(tài)較為多變，因此常常給臨床初次分離鑒定帶來困難。培養(yǎng)2 d一般可見菌落生長，在28℃溫度下培養(yǎng)5～7 d，SCDA培養(yǎng)基上菌落表面平坦、擴展、黑色，絨毛樣。SDA培養(yǎng)基上菌落表面平坦、擴展、橄欖灰綠色，絨面革樣。見圖1。多育節(jié)莢孢霉初步鑒定一般可用乳酸酚棉藍（或苯胺藍）染液染色后在熒光顯微鏡的400倍鏡下觀察，可見多育節(jié)莢孢霉以環(huán)痕產(chǎn)孢的方式產(chǎn)生分生孢子，分生孢子與菌絲相連的基部膨大，呈燒瓶形，分生孢子合軸成小堆，單細胞，透明到淡褐色，卵圓形到梨形，壁薄，光滑，見圖2。

3 菌種鑒定

3.1 表型鑒定

絲狀真菌的表型鑒定方法是利用碳水化合物和酶活性在40℃和45℃環(huán)境下生長。這些表型有助于菌種的鑒別，國外一些實驗室有使用。用于表型鑒定的商業(yè)試劑盒有Taxa Profile Micronaut（Marlin Diagnostika GmbH, Berlin, Germany） 和GENⅢMicroPlateTM（BiologInc,Hayward, CA,USA）[20-21]，用來檢查真菌的各種生化反應系統(tǒng)。在實際工作中，表型方法已經(jīng)基本被基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）鑒定和分子方法取代。

3.2 MALDI-TOF MS

盡管多位點DNA測序被認為是參考方法，MALDI-TOF MS能快速、相對經(jīng)濟地鑒定多育節(jié)莢孢霉感染，與許多分子方法相比具有相對的準確性，但前提是MS數(shù)據(jù)庫包含參考譜圖[22]。 Vitek?MS v3.0 （bioMerieux, Marcy L’etoile, France）在2017年7月被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準用于絲狀真菌鑒定，但不包含多育節(jié)莢孢霉的譜圖。其MALDI-TOF MS系 統(tǒng) 還 有MALDI Biotyper（Bruker Daltonics, Bremen, Germany）、Andromas（Andromas SAS, Paris, France） 和Axima-SARAMIS（Shimadzu/AnagnosTec,Duisburg, Germany）僅依靠這些數(shù)據(jù)庫也不足以鑒定多育節(jié)莢孢霉[23-24]。雖然在Bruker數(shù)據(jù)庫中有多育節(jié)莢孢霉，但4種菌株中只有1種被鑒定出來，然而4種菌株都是使用增強數(shù)據(jù)庫進行鑒定的，這表明檢測性能更依賴于數(shù)據(jù)庫中是否包含本地菌株的譜型。

一般有兩種方法：①雙甲酸夾心法[25]，即在靶板上先加1 μL甲酸，然后用無菌槍頭取絲狀真菌菌絲與甲酸充分混勻，自然干燥后再加1 μL的甲酸，最后在干燥后添加1 μL基質，然后放入質譜儀進行檢測。②甲酸乙腈萃取法，按照Bruker和Vitek MS系統(tǒng)推薦的絲狀真菌提取絲狀真菌蛋白，在此基礎上可以使用磁珠震蕩破壁、預加熱等[26]對破壁環(huán)節(jié)進行優(yōu)化。提取后取1 μL樣本點靶，自然干燥后添加1 μL基質，干燥后放入質譜儀進行鑒定。鑒定評分：每株菌點靶2次進行鑒定，記錄結果一致時的菌名和鑒定得分[27]，鑒定標準為鑒定到種水平得分≥1.7分或＜1.7分但所有鑒定結果一致為同一種菌；鑒定得分在1.5～＜1.7分可為屬水平，＜1.5分或者鑒定結果為多種菌，則鑒定結果不可靠。Sleiman等[28]通過將Bruker MS絲狀真菌數(shù)據(jù)庫與實驗室自己建立的包含4種節(jié)莢孢霉參考譜圖數(shù)據(jù)聯(lián)合使用，可將鑒定合格率從18%提升至94%。

3.3 分子生物學

對患者感染部位的標本進行PCR檢測是多育節(jié)莢孢霉感染的快速診斷方法，特別是在因真菌培養(yǎng)時間長而未報告結果之前。基于DNA序列的分析是目前所有真菌物種鑒定的“金標準”。對真菌的DNA進行識別，其特定區(qū)域能夠鑒別出多育節(jié)莢孢霉。滾動循環(huán)擴增（RCA）是使用簡單的恒溫擴增模式鑒定單核苷酸序列，有學者利用ITS-directed RCA鑒定出了多育節(jié)莢孢霉[29]。RCA的優(yōu)點是程序可以快速執(zhí)行（2 h內）且僅需要恒溫水浴，具有操作簡單和成本低的優(yōu)點。

3.4 二代測序技術（NGS）

應用NGS進行絲狀真菌的鑒定正在應用于臨床，但目前用NGS來鑒定多育節(jié)莢孢霉較少。國外的一項小型研究顯示檢測了一家醫(yī)院8個月分離的4株多育節(jié)莢孢霉[30]，各分離株間存在 10 000個單核苷酸多態(tài)性（SNP）。不同生物信息數(shù)據(jù)分析結果將干擾最終結果，在研究遺傳多態(tài)性時將真菌的這種多態(tài)性考慮在內也很重要。而且NGS檢測實驗周期長，檢測成本昂貴，對臨床標本要求也高，因此并不適用于微生物日常真菌鑒定工作，但在患者難確診病因且經(jīng)濟允許狀況下可供選擇。

4 診療現(xiàn)狀

4.1 診斷

臨床診斷多育節(jié)莢孢霉感染一般除了實驗室診斷外，更多的還是依靠患者的流行病學史、臨床特征、組織病理學、影像學和血清學進行診斷。

4.1.1 組織病理學 雖然用組織病理學的方法無法將真菌鑒別到種，但通過傳統(tǒng)染色，如鍍銀（GMS）染色，蘇木精和伊紅（HE）和過碘酸-希夫（PAS）染色，對侵襲性真菌感染（IFD）的診斷都有很高的臨床價值[31]。許多學者強烈推薦如高度懷疑多育節(jié)莢孢霉感染的患者可取組織進行組織病理學檢查[15,31]。多育節(jié)莢孢霉能產(chǎn)生色素沉著于菌絲上，因此可直接鏡檢觀察，組織病理學特點與曲霉感染相似，菌絲外觀透明，也有分枝、分隔，且呈銳角。有學者認為患者組織中的菌絲常有兩條平行菌絲分枝呈H型分布[31-32]，可作為組織病理學觀察依據(jù)，但并不具有特異性。

4.1.2 影像學 多育節(jié)莢孢霉引起的絲狀真菌侵襲性感染影像學主要表現(xiàn)為實變、結節(jié)、壞死性肺炎、肺膿腫和胸膜滲出[12,14]，無特異性可作為輔助診斷。

4.1.3 血清學 懷疑多育節(jié)莢孢霉感染的患者可進行G試驗，G試驗檢測的主要成分是真菌細胞壁抗原（1，3）-β-D-葡聚糖。（1，3）-β-D-葡聚糖存在于真菌的細胞壁中，在除毛霉和隱球菌感染外的IFD患者血液中能夠檢測到。G試驗檢測快速，血清、腦脊液、肺泡灌洗液等標本都可用于臨床檢測，由于某些抗真菌藥物（如米卡芬凈、卡泊芬凈等）會干擾G試驗的結果，一般推薦在抗真菌用藥前或用藥6 d內進行G試驗檢測[33]。其陰性預測值可達96%～100%，但特異性不高，因此一般用G試驗作為臨床高危人群篩查和輔助診斷[34]。

4.2 治療

國際上對于多育節(jié)莢孢霉感染在患病率和發(fā)病率數(shù)據(jù)上并沒有大數(shù)據(jù)支持，很大程度上來說是未知的[35]，而我國多育節(jié)莢孢霉感染病例報告較少[36]。Seidel等[3]分析了2000—2018年的相關數(shù)據(jù)（PubMed和FungiScope?registry），來自澳大利亞、美國、日本和西班牙等國家的56例多育節(jié)莢孢霉感染病例[澳大利亞（14例），美國和日本（各8例），西班牙（7例），法國和德國（各5例），其他國家（印度、意大利和英國各2例，巴西、荷蘭和波蘭各1例]被納入分析。分離的56株多育節(jié)莢孢霉中18株有藥敏結果（見表1），在所有抗真菌藥物的藥敏試驗中，MIC中位數(shù)為 8 mg/L或更高。偶有米卡芬凈、兩性霉素B或伏立康唑對分離株的MIC為1 mg/L或更低。除米卡芬凈外，所有被檢測的抗真菌藥物的MIC均至少為 4 mg/L。

表1 18株多育節(jié)莢孢霉菌株的體外藥敏

多育節(jié)莢孢霉對目前可選用的抗真菌藥物均具有一定耐藥性，而且由于存在著物種特異性易感模式，因此必須鑒定到種，才能準確地給予合理治療，使患者有一個良好的預后[37]。近幾年的研究顯示聯(lián)合抗真菌治療要比單藥治療的28 d生存率高（聯(lián)合治療24例，生存15例，生存率為63%；單藥治療16例，生存4例，生存率為25%）[38]。一般首選治療用藥是伏立康唑，近幾年研究顯示特比萘芬和伏立康唑聯(lián)合用藥后患者預后相對更好[13,39-40]。雖然特比萘芬一般不單獨用于臨床治療，但與伏立康唑聯(lián)合在體外具有協(xié)同作用，泊沙康唑也有一定程度上的協(xié)同作用。有文獻研究表明伏立康唑聯(lián)合兩性霉素B也有一定治療效果，但患者生存率相對較低[38]。而指南一般推薦伏立康唑為一線藥物聯(lián)合其他抗真菌藥物進行治療，通常將特比萘芬與伏立康唑聯(lián)合使用進行治療[35]。雖然聯(lián)合治療可以改善臨床表現(xiàn)但并不能根除真菌[41]，因此一般在藥物治療的同時用手術作為輔助治療，手術切除病變部位是治療多育節(jié)莢孢霉感染的重要手段，手術后患者預后較好。對于免疫功能缺陷患者在藥物治療的同時提高患者免疫功能也是治療的重要輔助手段。

4.3 預后

對于感染多育節(jié)莢孢霉的患者，其預后和感染者的基礎疾病和感染部位相關，侵襲性感染的患者預后差，平均生存率低，局部感染患者經(jīng)外科手術和抗真菌治療后預后較好。國內2019年報道顯示多育節(jié)莢孢霉感染僅3例[36]，1例局限性鼻竇感染患者外科干預后預后良好，2例侵襲性感染患者中1例死亡，另1例未知。國外2019年研究數(shù)據(jù)顯示多育節(jié)莢孢霉感染[3]中有惡性腫瘤的死亡率可達85.7%，惡性腫瘤中的侵襲性感染死亡率可高達91.7%；實體器官移植死亡率達85.7%；免疫功能正常的患者死亡率相對較低（25%）。

綜上所述，微生物實驗室檢測和病理學檢測都能輔助診斷多育節(jié)莢孢霉，其中PCR檢測和質譜鑒定可用于確診。而NGS方法常需要專業(yè)的檢驗人員和場所，而且由于NGS檢測費用較高，一般不推薦用于臨床常規(guī)檢查，除非一些疑難且無法確定病因的患者，但同時也要考慮患者經(jīng)濟條件。因此，在資源有限的情況下，真菌培養(yǎng)和形態(tài)檢測仍然是診斷的主要手段，在菌種鑒定方面，可優(yōu)先考慮質譜。因多育節(jié)莢孢霉感染存在早期診斷困難和診斷時間長的問題，我們應提高對該病的認識，并促進質譜和分子生物學鑒定的開展，從而提高早期診斷率，以便臨床及時合理治療改善患者預后，降低多育節(jié)莢孢霉感染的死亡率。