夏季奶牛場生物氣溶膠分布規律與環境影響因子研究

汝 林 鄧書輝 丁露雨 呂 陽 李奇峰 施正香

(1.黑龍江八一農墾大學工程學院， 大慶 163319； 2.黑龍江八一農墾大學土木水利學院， 大慶 163319；3.北京市農林科學院信息技術研究中心， 北京 100097； 4.國家農業信息化工程技術研究中心， 北京 100097；5.中國農業大學水利與土木工程學院， 北京 100083)

0 引言

我國奶牛養殖在集約化、標準化方向上快速發展，奶牛場的規模化養殖帶來效益的最大化，同時也對周邊環境造成了污染[1]。奶牛養殖過程中通過排泄物、飼料、墊料以及動物本身產生大量的微生物，這些微生物常以固體顆粒物或小液滴為載體形成生物氣溶膠懸浮在空氣中，引起各類氣源傳播疾病的發生，危害動物和養殖人員的健康，同時，由于環境因素變化，生物氣溶膠也可借助氣流運動向周邊環境傳播，從而造成生物污染，引發多點間人和動物的交叉感染[2-4]。生物氣溶膠作為引發疾病感染的重要途徑之一[5]，對其濃度及環境因子影響機制的研究與奶牛場周圍環境生物安全防控息息相關。

隨著社會各界關注度的提高，養殖業生物氣溶膠相關的研究也逐漸增多[6-7]，李超等[8]分別對5個豬舍使用ANDERSEN-6級采樣器在豬的鼻腔高度進行采樣，研究豬舍環境微生物菌群組成；高云航等[9]對不同飼養階段的牛舍選取1.2～1.5 m采樣高度進行樣品采集，研究空氣中的細菌、真菌濃度并分析其粒徑分布特征，但現有研究多以畜禽舍內環境及舍內生物氣溶膠研究為主[8-11]，缺乏對場區內、畜舍外氣溶膠變化規律的研究。相比于豬舍和雞舍，牛舍多為開放或半開放舍，建筑舉架高，舍內與舍外、舍與舍間、場內不同區域間空氣交換迅速，生物氣溶膠排放后在場內無組織傳輸，造成整場氣溶膠濃度變化。因此，研究場區的生物氣溶膠分布規律和影響因素對于了解牛場生物氣溶膠傳輸特征和阻控點更具有指導意義。

華北地區夏季高溫多雨，濕度較大，易滋生微生物，但同時紫外輻射較高，對微生物又有殺滅作用。本研究采集夏季天津市某牛場場區不同高度、不同位置的生物氣溶膠，研究奶牛場整場生物氣溶膠空間的分布規律，并建立濃度預測模型分析舍外溫度、相對濕度、風速、風向、總輻射強度、紫外輻射強度、懸浮顆粒物濃度等環境因子對其的影響，為后續牛場生物氣溶膠衰減速率及影響因子的研究提供先驗知識，為牛場生物污染排放測算、牧場疾病防控提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗牛場基本概況

圖1 奶牛場平面示意圖Fig.1 Plan of dairy farm1.奶廳 2.奶牛舍 3.青貯窖 4.草棚 5.料庫 6.機修及變電車間 7.宿舍 8.食堂 9.果園 10.辦公樓 11.專家樓 12.存糞料棚 13.糞場晾曬場 14.晾曬場 15.沼氣發酵罐 16.好氧池 17.收集池 18.干濕分離房 19.聯合用房 20.二沉池 21.混凝沉淀池 22.鍋爐房 23.氧化塘

試驗于天津市北辰區某標準化奶牛場進行，試驗牛場平面圖如圖1所示。天津市夏季主導風向為偏南風，為避免由于環境風因素對采樣造成影響，選取其南北為空曠地帶的奶牛場生產區1及糞污處理區進行試驗。該奶牛場奶牛舍為雙坡屋頂結構，采用自然風結合斜向風扇通風形式，舍長180 m、寬30 m、檐高4 m。生產區1配有奶牛舍5棟，由南至北分別為：后備舍、泌乳牛舍(3棟)、犢牛舍，并配有擠奶廳一個，每日擠奶3次(06:30—10:10、14:00—17:30和22:00—次日01:30)。場內奶牛每日投喂3次(06:30、14:00和17:20)，奶牛自由采食，試驗期間，場內采用吸糞車進行清糞，每日清糞2次(06:30—10:10和14:00—17:30)，吸糞車直接運到類污處理區進行干濕分離，并在此區域進行干糞平鋪、翻轉和晾曬，處理后堆至存糞料棚用于墊料回填。場內實行消毒車全天流動消毒，每周3次。

1.2 采樣與分析方法

于2021年5月11日—6月1日進行采樣試驗，其中5月11—20日對采樣區1(生產區1+糞污處理區，圖1，表1)進行采樣試驗，5月22日—6月1日對采樣區2(生產區1，圖1，表2)進行采樣試驗，選取各測試區域邊界方向中間點作為東南西北采樣點進行生物氣溶膠采集，于當日13:00—16:00進行采樣，每日采樣一次，采樣高度選取為近地面1 m及 4 m。使用安德森六級采樣器(TISCH，美國Tisch Environmental Inc公司)采集牛場環境中的空氣樣品，采樣介質使用一次性營養瓊脂平板(常德比克曼生物科技有限公司)，為確保平皿上采集到的需氧菌個數處于0～300之間以減小誤差、方便計數，采樣時間控制為5～10 min，采樣主機流量設置為28.3 L/min。現場采樣結束后，于恒溫培養箱中37℃倒置培養48 h后開始計數[10-11]，計數設備采用全自動菌落計數器(Icount-30F型，杭州訊數科技有限公司)。試驗過程中確保操作無菌，每次采樣后需對設備進行酒精擦拭消毒清理。同時采集環境參數：溫度(T)、相對濕度(RH)(1次/5 min，美國ONSET公司HOBO-MX2301A型空氣溫濕度記錄儀，測量范圍：-40～70℃和0～100% RH，測量精度：±0.25℃(-40～0℃)、±0.2℃(0～70℃)和±2.5%(從10%～90%典型)，最大±3.5%，包括25℃時的滯后；RH低于10%或高于90%時典型±5%)；風速(V)、風向(WD)(1次/30 s，英國Gill公司WINDMASTER PRO型三維超聲風速儀，測量范圍：0～65 m/s和0°～359°，精度：<1.5% RMS和±2°)；總輻射強度(GHI，1次/30 s，日本EKO公司MS-40型總輻射計，測量范圍：285～3 000 nm，0～2 000 W/m2，精度：誤差小于讀數的5%(方向響應：<20 W/m2，溫度響應(-10～40℃)：<3%；傾斜響應：±1%))；紫外輻射強度(UV，1次/30 s，荷蘭K&Z公司CUV5型紫外輻照計，測量范圍：280～400 nm，0～400 W/m2；精度：日不確定性為讀數的5%(方向響應：<5%，非線性誤差：<1%，溫度響應：<-0.3%/℃))；懸浮顆粒物(PM1、PM2.5、PM10、PM100)濃度采用中國農業大學研制的多通路PMU(1次/5 min，其中PM1、PM2.5、PM10濃度測量采用北京攀藤科技有限公司PMSX003N型數字式通用顆粒物傳感器，測量范圍：0～1 000 μg/m3，精度：±15 μg/m3；PM100濃度測量采用濟南諾方電子技術有限公司SDS198激光PM100傳感器，測量范圍：0～20 mg/m3，精度：±30 μg/m3)進行測量。

表1 采樣區1各采樣點四周地形情況Tab.1 Terrain around each sampling point in sampling area 1

表2 采樣區2各采樣點四周地形情況Tab.2 Terrain around each sampling point in sampling area 2

1.3 計數統計

現場樣品采集后，經48 h培養，對培養皿上氣載需氧菌菌落計數。由于采樣器采集時會出現多個細菌由一個孔洞通過而產生重疊，造成計數誤差，因此需對每一級采樣菌落數進行校正[12]，校正后計算其氣載需氧菌濃度。校正公式為

(1)

式中Pr——校正后菌落數，CFU

N——采樣器各級采樣孔數，取400個

r——實際菌落數，CFU

氣載需氧菌濃度公式為

(2)

式中C——氣載需氧菌濃度，CFU/m3

M1～M6——各級采樣器校正后菌落數，CFU

F——采樣器采樣流量，取28.3 L/min

t——采樣時間，min

1.4 數據處理與分析方法

對每次采樣時間點前后5 min內的環境參數進行抽取，計算其采樣時間段內各項參數平均值，采用Origin 2018繪制風玫瑰圖，Excel、SPSS、Spyder(Anaconda3)等軟件進行數據及可視化處理。利用隨機森林模型建立多元環境因子對氣溶膠濃度的預測模型，提取各采樣點環境參數：風向、風速、溫度、相對濕度、總輻射強度、紫外輻射強度、懸浮顆粒物濃度及氣溶膠濃度建立環境因子數據集，按照比例8∶2劃分為訓練集和測試集參與建模。隨后分別將單一環境影響因子設置為0，輸入預測模型，獲得10組濃度預測值，計算每組濃度預測值與真實值的差值作為環境因子對模型的影響程度，計算式為

(3)

式中E——環境因子對模型的影響值，CFU/m3

Pi——控制單一環境因子設置為0后的預測值，CFU/m3

R——參與建模的真實值，CFU/m3

Q——測試集包含數據量

2 結果與分析

2.1 采樣點環境因素

對采樣周期內每日采樣時間段內環境數據進行算術平均處理，獲得數據進行可視化分析后發現：采樣周期內舍外環境的風向變化較為頻繁(圖2a)，以西南、西北、東北、南風向出現次數最多；舍外風速變化較為穩定，集中在4～5 m/s、6～7 m/s，平均風速為4.02 m/s。風向風速是生物氣溶膠傳輸的動力因子[13]，風向變化頻繁可能對場內不同區域氣溶膠濃度分布影響較大。紫外輻照強度與總輻射強度變化一致，部分時間由于陰雨天氣原因造成數據突變(圖3a，5月15、24、31日)，其余時間變化較為規律。測試期間，舍外溫度集中在20～30℃之間，變化較為平穩，但相對濕度受降雨影響，采樣周期內日間變化較大。空氣懸浮顆粒物日間變化差異較大(圖3b)，其中PM1、PM2.5、PM10變化趨勢較為一致，PM100于5月23—26日與其余懸浮顆粒物變化差異較大，根據實際情況分析可能是由于采樣點位于雜草荒地且距離糞污晾曬棚較近，該時間段內其主導風向為南風，風速集中在8～10 m/s(圖2b)，易受地形環境及風速影響產生較大變異。綜上所述，由于各項環境因素受其他環境因素影響也較為明顯，因此在進行室外環境因素影響氣溶膠規律的研究時，需要綜合考慮多環境因素整體對氣溶膠規律的影響進行分析。

圖2 試驗周期內風環境變化情況Fig.2 Change of air environment in test period

圖3 試驗周期內環境因子變化曲線Fig.3 Variation curves of environmental factors during test period

2.2 采樣點生物氣溶膠濃度

對各采樣區試驗周期內采樣點生物氣溶膠濃度進行整理，抽取各采樣點數據進行分析。由于生物氣溶膠濃度試驗數據較少且數值間浮動較大，因此采用中間值及最值來表示樣品數值間的波動范圍。試驗結果表明，試驗奶牛場生物氣溶膠濃度為1.50×102～1.61×104CFU/m3，且多集中在103數量級。試驗期間各采樣區試驗周期內各采樣點數據如表3所示。

對采樣區不同高度采樣點濃度數據進行差異性檢驗。經分析發現，在采樣周期內(20 d)兩采樣區近地面1 m采樣點處濃度顯著高于4 m高度采樣點濃度(P<0.01)。孫宏起[14]、李晏等[15]對奶牛舍內不同位點、不同高度(0.5、1.0、1.5 m)的氣溶膠濃度進行了采集，雖然部分采樣點存在低處濃度最高的情況，但其濃度與距地面高度無明顯相關性(P>0.05)，分析是由于舍內環境變化較為穩定，氣溶膠粒子充分彌漫舍內，因此高度分布上差異不大。而本文舍外環境相較于舍內環境較為開闊，氣溶膠粒子充分擴散，因此不同高度上存在差異。慕飛飛[16]對西安市微生物氣溶膠垂直分布特征研究時發現，不同高度微生物氣溶膠濃度具有差異，即低處濃度略大于高處濃度。本試驗中，奶牛場相較于城市地面污染較為嚴重，因此出現低處濃度顯著大于高處濃度的情況。兩采樣區各采樣點數據可視化處理發現，部分日期的個別采樣點并不滿足低處濃度大于高處的規律(如采樣區2采樣點B、C，圖4)，結合

表3 各采樣區周期內生物氣溶膠濃度Tab.3 Bioaerosol concentration in sampling period of each sampling area CFU/m3

2.1節對現場環境條件的分析，可能是由于試驗時間內環境因素多變(圖2a和圖3)，多元環境因子耦合對氣溶膠粒子濃度作用的影響。因此后期對環境因素進行相應分析，判定其對氣溶膠濃度的影響機制。

圖4 采樣區2采樣點B、C 10日內生物氣溶膠濃度變化曲線Fig.4 Change curves of bioaerosol concentration in sampling points B and C of sampling area 2 within 10 days

2.3 采樣點粒徑分布

對兩采樣試驗區各采樣點不同高度采集到的樣品培養48 h，分別計算試驗周期內每日各采樣點樣品不同粒徑范圍，即各級采樣器上不同粒徑菌落數所占比例，探究其粒徑分布規律。對采樣周期內每日各采樣點樣本粒徑分布數據進行可視化處理，選取各區最具有代表性的5月16日(采樣區1)、5月26日(采樣區2)數據進行分析。對比分析發現，大部分樣本在粒徑分布上存在粒徑越小所占總體百分比越小的情況，且在粒徑大于2.1 μm的粒子數量上，兩采樣區不同高度多數采樣點達到了80%，這與方治國等[17]的研究結果一致，各采樣點不同層級粒子數量不同，多數采樣點第一級粒子數量占比最高，這與鐘召兵等[18]的研究相同，且在大部分采樣點的不同高度上，其不同粒徑范圍粒子所占比例趨勢接近一致(圖5)。

同時，有個別采樣點不遵循以上規律，結合當日環境因素及采樣地點進行分析，受風向風速影響，上下風向采樣點處易出現粒徑分布不規律情況，5月16日采樣時間內主導風向為南風(圖6a)，且該采樣點位于糞污處理區，生物氣溶膠通常伴隨著糞便排泄和處理過程而產生[19]，因此采樣點D出現明顯差異情況可能是受到糞污環境因素影響，而對于采樣點A，由于其四周建筑遮擋，風環境變化較為平穩，因此該采樣點每日粒徑分布情況較為穩定且符合總體規律。5月26日采樣時間內風向多為西風、西北風、西南風(圖6b)，因此其東西采樣點處規律存在顯著差異，而其北側采樣點D由于較采樣區1相比已經遠離了糞污堆放車間，因此其粒徑分布也較為穩定。

圖5 5月16、26日各采樣點粒徑分布Fig.5 Dispersion of particle size at each sampling point on May 16 and 26

圖6 5月16、26日風環境變化情況Fig.6 Wind environment change on May 16 and 26

2.4 多元環境因子對生物氣溶膠濃度的影響

以上對整場濃度分析情況表明，多元環境因子耦合會對生物氣溶膠濃度產生影響，因此以隨機森林算法(Random forest，RF)為基礎構建生物氣溶膠濃度預測模型，利用均方誤差(Mean squared error，MSE)評價模型效果，MSE取值范圍為[0，+∞)，取值越趨近于0，模型收斂程度越好。利用環境因子數據集訓練預測模型，設置訓練輪數為100輪，保存訓練完成后的最優模型判定環境因子對濃度的影響程度。結果表明，生物氣溶膠濃度預測模型的MSE為0.009 4，具有很好的預測效果。

對獲得數據進行可視化處理，得到各環境因子對生物氣溶膠濃度的影響程度。如圖7a所示，環境因子對生物氣溶膠濃度的影響由大到小依次為：WD、PM100、T、UV、GHI、PM1、PM10、V、PM2.5、RH，且部分因子之間極為接近，如WD與PM100均為0.078 3 CFU/m3。為進一步判斷環境參數間的可替代關系，對環境因子進行層聚類分析，判斷各環境因子之間的共線性關系，結合各因子對氣溶膠濃度影響程度，篩選出可被替換環境因子，以到達節省現場環境數據采樣成本的目的。

圖7 環境因子對生物氣溶膠濃度影響值及層聚類分析結果Fig.7 Influence of environmental factors on bioaerosol concentration and results of hierarchical cluster analysis

各環境因子層聚類分析結果如圖7b所示，距離越小代表環境因子間共線性越強。結果表明，PM1、PM2.5與PM10，GHI與UV之間具有強共線關系。其中，PM2.5與PM10影響值僅相差0.000 7 CFU/m3且二者影響值均小于PM1，GHI與UV對濃度影響值相近，差值僅為0.003 CFU/m3，因此保留各組中影響值最高的環境因子，使用PM1代替PM2.5與PM10，UV代替GHI。

圖7a中環境因子還可劃分為氣象因素和空氣污染物兩類，氣象因素影響值(平均值為0.076 6 CFU/m3)普遍高于空氣污染物影響值(平均值為0.076 2 CFU/m3)，證明相對于空氣污染物，氣象參數對空氣細菌群落的影響更大，與文獻[20-21]研究結果一致。

氣象因素方面，風向因子對生物氣溶膠濃度的影響程度最大。有學者對舍內氣溶膠濃度研究發現，通風頻率對生物氣溶膠中大部分顆粒的形態和濃度會產生決定性作用[22]，這其中包括風向及風速的變化，但對于舍內通風而言，擾流風扇及換氣扇均為單一方向，風向因素較為單一。而根據環境因素可視化分析(圖2a)可知，在奶牛場室外空曠田野環境中，采樣周期內風速較為平穩但風向多變，因此本文結果中風向因子較風速因子對整場的氣溶膠濃度的影響較大。當氣溫高于24℃時，空氣中細菌的存活率會普遍下降[23]，對氣溶膠濃度造成較大影響，而本文的結果也對該分析進行了論證，本試驗周期內平均溫度為26.87℃，溫度的影響值在氣象因素中僅次于風向，高溫因素應該對生物氣溶膠濃度產生較大影響。其他學者對于城市中不同季節環境參數對于氣溶膠濃度的影響研究表明，在各季節環境因素影響程度上，相對濕度影響程度較高，但其他學者提出，對于不同背景下的氣溶膠濃度，污染源在空氣傳播細菌群落方面發揮了主導作用[24-25]，這些影響甚至比氣象條件造成的影響更大[24]，并且由于溫度和相對濕度對生物氣溶膠的影響存在交互作用[19]，兩者的綜合影響使蛋白質和膜磷脂失活，表現在溫度和相對濕度對生物氣溶膠的濃度[26]、活性[27]、類型和群落結構[28-29]的影響方面。孔德龍等[30]在對某高校校園夏季微生物濃度研究中也發現，溫度對于細菌濃度及總微生物濃度的影響非常顯著，而相對濕度對微生物濃度無明顯影響。因此本文認為由于試驗污染源場地不同，造成了本試驗結果中，相對濕度影響排序相較于城市中環境因素對于氣溶膠的影響排序不同，并且由于溫度因素在本試驗中的較高影響程度導致相對濕度的影響并不明顯，僅排在了末位。

本試驗還采集了日照中紫外輻射強度及總輻射強度。其中紫外輻射常被應用于醫療環境及實驗室環境的殺菌技術當中[31-33]，DO-KYUN等[34]使用紫外線發光二極管照射多種菌類及病毒發現，對于紫外輻射強度，細菌抵抗能力最弱，其細胞組成物質(核酸、蛋白質)的分子結構也最易被破壞[35-36]，最終死亡。本試驗中，紫外線輻射強度影響程度略高于總輻射強度，且根據聚類分析發現，二者之間具有極強的共線性，由此可知，總輻射強度在本試驗環境條件下可被紫外輻射強度替代。而紫外輻射對于微生物殺滅效果主要與環境的相對濕度、輻射強度、密閉空間相關[37]，奶牛場環境開闊，且本文相對濕度對于氣溶膠濃度影響相對不高，因此紫外輻射強度及太陽總輻射強度影響值低于溫度、風向等因素。

空氣污染物方面，在畜禽場中，動物運動與機械生產導致糞污中空氣灰塵飛揚，造成空氣污染顆粒物濃度增大，極大地影響了氣溶膠的濃度，但GAO等[38]運用主成分分析對環境因子影響氣溶膠濃度的研究中發現，影響可培養生物氣溶膠的因素主要與霾度、采樣時間和季節相關。在不同的霾度水平上PM10與溫度對氣溶膠濃度的相關性不同，在霾度高峰值背景下PM10影響氣溶膠濃度，只與采樣時間具有明顯關系，而PM2.5對氣溶膠濃度只具有季節性影響。而在本文試驗中，由于只在夏季中午固定時間內進行樣品采集，所以在影響值呈現中，PM10與PM2.5相較于其他因素所占影響值并不高。層聚類分析發現，PM1與PM2.5、PM10具有極強的共線性，因此三者的影響值較為接近，根據前文環境因素分析，PM100濃度明顯高于其他顆粒物濃度，并且在5月23—26日的采樣時間內，其濃度產生了較大變化且大幅增加，附著在空氣懸浮顆粒物上的生物氣溶膠會隨著顆粒物的積累而增加，由于以上原因，PM100對氣溶膠濃度的影響最大。

同時，對替代后的7種環境因子重新建立模型，得到MSE(0.009 0)與采用10種環境因子建立模型得到的MSE(0.009 4)相差極小，因此認為環境因子的取代對模型無較大影響。PM10、PM2.5與GHI等環境因子對生物氣溶膠濃度影響可以被其他因子取代，部分保留的因子，這與國內部分學者對于影響生物氣溶膠特征環境因子的研究結論相同[39-40]，可為接下來的環境因子研究提供一定借鑒。

綜上所述，奶牛場整場生物氣溶膠濃度受多種環境因子影響，相較于空氣污染物，氣象因子總體對奶牛場的生物氣溶膠濃度影響較大，通過生物氣溶膠濃度預測模型獲得環境因子影響程度排序，發現PM100和風向對濃度的影響程度最大，為進一步分析各因子之間的可替代性，利用層聚類分析得到兩組具有強共線性的環境因子，可將原有10個因子縮減為7個因子，為后期探究環境因子對氣溶膠濃度影響的研究奠定基礎，對了解奶牛場生物氣溶膠傳輸特征和阻控點更具有指導意義。

3 結論

(1)奶牛場室外環境低處生物氣溶膠濃度明顯高于高處生物氣溶膠濃度，在奶牛場整場區域范圍內，生物氣溶膠濃度在空間分布上1 m處明顯大于4 m處(P<0.01)，但受風向、風速等環境因素影響，會在個別采樣點存在變異點。

(2)奶牛場整場不同采樣點不同粒徑粒子的分布上，粒徑大于2.1 μm的粒子數量多數采樣點達到了80%，高度1 m和4 m處不同粒徑粒子所占比例趨勢趨于一致。同時，采樣點受大氣環境因子尤其是風速、風向的影響較大，對其粒徑分布規律易造成較大影響。

(3)奶牛場整場生物氣溶膠濃度受多種環境因子影響，氣象因子相較于空氣污染物對微生物氣溶膠濃度具有較大影響，且各環境因素對生物氣溶膠濃度的影響由大到小依次為：WD(0.078 3 CFU/m3)、PM100(0.078 30 CFU/m3)、T(0.078 10 CFU/m3)、UV(0.078 00 CFU/m3)、GHI(0.077 70 CFU/m3)、PM1(0.077 30 CFU/m3)、PM10(0.075 00 CFU/m3)、V(0.074 7 CFU/m3)、PM2.5(0.074 30 CFU/m3)、RH(0.072 40 CFU/m3)，其中，WD和PM100對濃度影響最大。通過層聚類分析可知，可利用PM1與UV分別替代PM10、PM2.5與GHI，且不影響濃度預測模型的精度。