不同濃度二甲雙胍對丙泊酚所致斑馬魚神經毒性的改善作用

楊廣慧 沈佳紅 於陽 黃婭琴 徐佳雯 程遠 孫建良

丙泊酚是目前臨床上最常用的靜脈麻醉藥之一，具有起效迅速、代謝快、蘇醒平穩等特點，尤其適用于嬰幼兒手術麻醉。然而，和其他麻醉藥物具有神經毒性類似，胎兒及嬰幼兒早期接觸丙泊酚可引起神經系統功能障礙，出現學習能力及認知功能的下降[1]。二甲雙胍是雙胍類降糖藥，通過抑制肝糖原輸出、增加胰島素敏感性、抑制糖異生等途徑降低血糖，且幾乎無乳酸酸中毒及低血糖等不良反應。近年來發現二甲雙胍不僅有突出的降低血糖功能，同時對神經系統有保護作用[2-5]。斑馬魚是一種新型動物模型，其基因與人類基因序列同源度高，近年來廣泛應用于神經科學研究，具有體外受精、胚胎透明而易于觀察及操作等特點，已成為篩查藥物的首選動物模型之一[6]。筆者通過建立丙泊酚所致斑馬魚胚胎神經毒性模型，探討二甲雙胍對該模型的作用，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 野生型AB品系斑馬魚雌雄配比2∶1，自然成對交配收集受精后6 h（6 hpf）胚胎，胚胎放入養魚用水中培養，顯微鏡（日本 OLYMPUS公司，型號：SZX7）下確認發育處于相同階段后入組實驗，共300個。鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準字：H20023370，規格：0.5 g/片）；丙泊酚注射液（愛爾蘭Aspen Pharma Trading公司，注冊證號：H20171275，規格：10 mg/ml）；吖啶橙染料（美國 Sigma公司，批號：494-38-2）；電動聚焦連續變倍熒光顯微鏡（日本Nikon公司，型號：AZ100）；行為學分析儀（法國ViewPoint Life Sciences公司，型號：V3.11）。斑馬魚胚胎均培養于28℃的養魚用水中（水質：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為450～550 μS/cm，pH 為 6.5～8.5，硬度為 50～100 mg/L CaCO3）。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理 將150個斑馬魚胚胎按隨機抽樣法分別置于6孔板中，30個/孔，每孔為一組，共5組。將二甲雙胍1.5、3、6 mg分別加入3 ml養魚用水中，濃度分別設置成二甲雙胍500 μg/ml（M1組）、1 000 μg/ml（M2組）和2 000 μg/ml（M3組），另外兩組分別為無二甲雙胍的丙泊酚對照組（P組）及正常對照組（C組）。其中P組、M1組、M2組及M3組均加入丙泊酚5 μg/ml[7]，C組不作任何處理，正常培養于養魚用水中。所有實驗組每孔容量均為3 ml。

1.2.2 中樞神經細胞凋亡檢測 經28℃培養1 d后，將斑馬魚胚胎剝除卵膜，并用超純水清洗2次，于含有濃度為2.5 μg/ml吖啶橙的培養液中避光培養30 min，超純水清洗3遍，染色后每組采用隨機抽樣法抽取10個置于熒光顯微鏡下拍照，使用NIS-Elements D 3.20軟件采集并分析斑馬魚胚胎中樞神經細胞凋亡數。

1.2.3 反應能力評估 其余150個斑馬魚胚胎分組及處理同1.2.1。28℃培養5 d后，每組采用隨機抽樣法抽取10條斑馬魚進行反應能力評估。行為學分析儀采集20 min內2個明暗周期（即黑暗5 min、光照5 min交替2個周期）的運動速度，分析每分鐘平均運動速度[8]。

1.3 統計學處理 采用SPSS 26.0統計軟件。計量資料用表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnet檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組斑馬魚胚胎中樞神經細胞凋亡數的比較 C組中樞神經凋亡細胞數為（12.90±1.21）個，P組為（23.10±2.12）個，差異有統計學意義（P＜0.01），表明丙泊酚5 μg/ml可致斑馬魚胚胎中樞神經細胞凋亡。M1組、M2組及M3組中樞神經凋亡細胞數分別為（20.30±1.96）、（18.10±2.01）和（11.40±1.79）個。與 P組比較，M3組中樞神經細胞凋亡數明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.01），說明經 2 000 μg/ml二甲雙胍處理，中樞神經細胞凋亡情況得到改善，見圖1、2（插頁）。

圖1 斑馬魚胚胎中樞神經細胞凋亡分析部位示意圖（黃色虛線內為分析部位，綠色小點為凋亡細胞）

圖2 5組斑馬魚胚胎中樞神經細胞凋亡表型圖（綠色小點為凋亡細胞）

2.2 各組斑馬魚反應能力的比較 C組每分鐘平均運動速度為（2.06±0.08）mm/s，P 組為（0.91±0.08）mm/s，差異有統計學意義（P＜0.01），表明丙泊酚 5 μg/ml可致斑馬魚每分鐘平均運動速度明顯減慢，反應能力降低。M1組、M2組及M3組每分鐘平均運動速度分別為（0.85±0.07）、（1.15±0.06）和（1.46±0.08）mm/s，與P組比較，M2組和M3組每分鐘平均運動速度增快，差異均有統計學意義（均P＜0.05），說明經1 000和2 000 μg/ml二甲雙胍處理后，斑馬魚反應能力得到改善。

3 討論

神經細胞凋亡是大腦發育的一個重要環節，在大腦發育建立中，神經細胞初始數量遠超生理需要，其中50%～70%會走向凋亡，故細胞凋亡是神經發育的重要組成部分，一旦凋亡程序被外界因素干擾，就會使發育畸形的概率增加。有研究發現丙泊酚可引起神經細胞凋亡，導致認知功能障礙[9-10]。二甲雙胍作為廣泛使用的降糖藥，近年來發現對神經系統損傷具有保護作用[2-5]。在顱內腫瘤放療后患兒中，使用二甲雙胍可以明顯改善其認知功能[2]。動物實驗也證實二甲雙胍對中風后的小鼠具有神經修復功能[3]，二甲雙胍處理的小鼠形成新的記憶比對照組小鼠快[4]。

在分子生物學水平上，二甲雙胍對神經系統的保護作用機制尚不完全清楚。腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]，是目前二甲雙胍在體內最主要的作用靶點之一。CREB結合蛋白（CREB-binding protein,CBP）在胚胎神經前體細胞的發育過程中必須存在，CBP需要被非典型蛋白激酶C（atypical PKC,aPKC）激活才能完成此作用。aPKC-CBP是AMPK的下游通路之一，二甲雙胍作為AMPK的激動劑可以激活神經前體細胞中aPKC-CBP通路[11]，進而促進神經細胞生長及修復[4-5，12]。

在沉默信息調節因子1（silent information regulator 1,SIRT1）及過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子 1α（peroxlsome proliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α,PGC-1α）相關通路領域，已有的研究表明AMPK-SIRT1信號通路的功能紊亂可誘導七氟烷所致的神經細胞凋亡和認知功能障礙[13]。而AMPK的激動劑可以激活AMPK-SIRT1-PGC-1α通路，該通路通過抑制氧化應激和提高線粒體功能，從而減少七氟烷麻醉所致神經細胞的凋亡、發揮抗氧化作用及改善認知功能[14]。AMPK可以增加還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NADH）的水平，繼而誘導激活SIRT1，而SIRT1的乙?；梢赃M一步激活促進PGC-1α的表達。PGC-1α通過結合過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor,PPARγ），調節線粒體生物合成的關鍵蛋白并促進線粒體的功能和代謝。線粒體是自由基產生和誘發凋亡的重要場所，七氟烷麻醉可以引起術后認知功能障礙模型中大鼠海馬區發生氧化應激，使氧自由基產生積累，積累的自由基可以通過過氧化線粒體膜的脂質，進而激活線粒體凋亡，最終引起神經細胞的凋亡。而七氟烷引起的氧化應激可以使用AMPK的激動劑逆轉，具體表現為激活AMPK-SIRT1-PGC-1α可以逆轉由于七氟烷麻醉導致的大鼠海馬凋亡神經細胞數目的減少、cleaved天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-3）上調，線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,MMP）和 ATP 的下調[14]。

已有研究證明，丙泊酚所致神經細胞凋亡與中樞炎癥及氧化應激有關，表現為丙泊酚可致大鼠活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）、氧化應激產物2,4-二硝基酚（2,4-dinitrophenol,DNP）和4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal,HNE）及凋亡執行蛋白caspase-3等表達升高[9]。筆者推測丙泊酚亦可能通過干擾AMPK通路加重認知功能障礙，而二甲雙胍作為經典AMPK激活劑，推測可以通過激活AMPK而產生丙泊酚麻醉后神經保護作用。故后續的研究仍需進一步驗證二甲雙胍對丙泊酚誘導神經毒性改善的具體分子機制。

本研究發現，二甲雙胍1 000 μg/ml可以改善丙泊酚所致斑馬魚反應能力減低（P＜0.05），但對于中樞神經細胞凋亡數的改善尚不明顯（P＞0.05）。二甲雙胍2 000 μg/ml可以同時改善丙泊酚所致斑馬魚中樞神經細胞凋亡（P＜0.01）及反應能力降低（P＜0.01），故筆者推測二甲雙胍對丙泊酚所致的神經毒性的保護作用存在濃度依賴。

綜上所述，二甲雙胍可以改善丙泊酚所致斑馬魚神經毒性，具體機制有待于進一步研究。