干擾素-γ消除腫瘤相關成纖維細胞介導非小細胞肺癌細胞輻射抵抗的實驗研究

韓若臻 項林敏 邱恩毅 董事 翁欣然 胡呈呈 陳恩樂

肺癌位居惡性腫瘤相關死亡率第一位，其中非小細胞肺癌占肺癌總數約80%[1-2]。放療已成為治療肺癌的重要手段之一，但部分患者對放療抵抗，甚至出現放療后腫瘤進展[3]。腫瘤基質對腫瘤細胞發生、發展和治療抵抗起到支持作用，而腫瘤基質中腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）為腫瘤組織中主要成分之一 ，后者對腫瘤細胞起到保護作用，誘導腫瘤細胞產生對治療抵抗，同時促進腫瘤發生轉移[4-5]。此外，電離輻射可誘導CD8+T細胞浸潤于腫瘤組織中，而腫瘤微環境中CD8+T細胞豐度與腫瘤患者預后呈正相關[6]。CD8+T細胞能在殺傷腫瘤細胞的同時釋放干擾素-γ，干擾素-γ通過作用于CAFs來減少谷胱甘肽（glutathione,GSH）和半胱氨酸釋放，進而消除其介導的化療耐藥作用[7]。但干擾素-γ能否通過這一途徑來消除CAFs對輻射后腫瘤細胞的保護作用，對此，本研究觀察了干擾素-γ消除CAFs介導的非小細胞肺癌細胞輻射抵抗的效果，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人肺腺癌細胞系A549、人肺鱗癌細胞系H460購自中科院上海細胞庫。DMEM全培養基、10%FBS、青霉素、鏈霉素購自美國Thermo Fisher公司。細胞蛋白抽提試劑盒和聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）快速制備試劑盒、人FAP-PE流式抗體購自美國Bio-Rad公司。CCK-8試劑盒、半胱氨酸標準品、胱氨酸標準品、GSH檢測試劑盒、GSH合成酶抑制劑（丁硫氨酸-亞砜亞胺，BSO）購自上海碧云天生物技術有限公司。Transwell小室購自美國Corning公司。流式抗體 CD105-APC、CD44-APC、EPCAM-FITC、Annexin-V-FITC、PI、CD45-APC 購自美國 eBioscience公司。DNA損傷修復蛋白γH2AX、胱氨酸轉運蛋白xCT抗體、信號傳導及轉錄激活蛋白1（STAT1）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司。7-氟苯呋咱-4-硫酸銨鹽（SBD-F）購自美國Sigma公司；高效液相色譜檢測涉及的三氯乙酸、EDTA-2Na、磷酸鹽、醋酸鈉、冰醋酸、氯化鈉、氫氧化鈉和四硼酸鈉十水合物試劑均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。高效液相色譜儀（AA9800）購自美國蘭博公司。

1.2 方法

1.2.1 CAFs提取及鑒定 CAFs從2020年12月至2021年6月溫州市中心醫院胸外科行根治性切除的15例肺癌患者的組織標本中提取，其中肺腺癌11例，肺鱗癌4例；患者術前均無放化療治療史。具體方法：術中冷凍切片證實為非小細胞肺癌后，切取1 cm×0.5 cm腫瘤組織置于DMEM全培養基中，1 h內轉移至實驗室超凈臺，用PBS液沖洗標本5遍，將標本剪成約0.3 cm×0.3 cm大小的組織塊，置于T25培養瓶中，加入2 ml DMEM全培養基，置于培養箱中，6～12 h后再加入2 ml培養基。培養過程中，可見CAFs貼壁于標本周圍，7～10 d內長滿。將第3～6代CAFs用于后續實驗。取0.5×106個細胞接種于無菌載玻片中，細胞完全貼壁后去除培養基，PBS洗2次，加入4%多聚甲醛，24 h后提取載玻片進行HE染色及免疫組化染色，平滑肌肌動蛋白（smooth muscle actin,SMA）為CAFs特異性蛋白之一，若細胞質染色呈褐色表示陽性；將消化后的CAFs采用流式細胞術檢測，進行流式抗體（CD105、CD44、FAP、CD45、EPCAM、CD24）染色及鑒定，以確定是否為CAFs細胞。

1.2.2 細胞培養 A549、H460、CAFs細胞培養于DMEM全培養基中，該培養基含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素。細胞在37℃ 、5% CO2培養箱中培養，0.25%胰酶消化后按1∶3比例傳代，傳代間隔時間為2～3 d。

1.2.3 細胞輻射 分別將10×106個的A549和H460細胞置于含15 ml DMEM全培養基的15 ml離心管中。將離心管置于瓦里安（23EX）直線加速器中輻射，輻射劑量為10 Gy，共3 min。輻射結束后，離心管重新置于冰上并轉運回實驗室。

1.3 CAFs與輻射后腫瘤細胞共培養

1.3.1 Transwell法 在24孔Transwell體系中，輻射后的腫瘤細胞與 CAFs鋪板數目比例為1∶2，0.2×106個腫瘤細胞鋪板于下室（無CAFs組），0.4×106個CAFs細胞鋪板于上室（CAFs組），共培養36 h。

1.3.2 CAFs細胞上清培養法 3×106個CAFs鋪板于10 cm細胞培養皿中，48 h后收集上清液于15 ml離心管，2 500 r/min離心5 min，上清液經0.22 μm過濾器過濾。取0.2×106個輻射后腫瘤細胞鋪板于24孔板，12 h后吸棄細胞培養基，加入CAFs細胞上清液500 μl，36 h消化細胞并通過流式細胞儀檢測細胞凋亡；CAFs完全貼壁后，在細胞培養基中加入干擾素-γ（終濃度為5 ng/ml）或者BSO（終濃度為 0.1 mmol/L），作用8 h后，更換培養基并收集48 h后CAFs細胞上清液，用于后續共培養及上清液相關指標檢測實驗。

1.4 腫瘤細胞凋亡檢測 分別收集Transwell體系中各輻射后A549和H460細胞于1.5 ml EP管中，離心后吸除上清液，250 μl Annexin-V buffer重懸腫瘤細胞。往細胞懸液中加入Annexin-V流式抗體和碘化丙啶（PI）各 0.25 μl，室溫避光孵育 15 min；孵育結束后，2 500 r/min 離心 5 min，150 μl Annexin-V buffer重懸細胞，上機檢測Annexin-V和PI。Annexin-V陽性代表細胞早期凋亡，Annexin-V和PI雙陽代表細胞晚期凋亡，兩種比例之和表示細胞凋亡占比。

1.5 腫瘤細胞活性檢測 采用CCK-8法。0.2×106個輻射后腫瘤細胞鋪板于96孔板中，各實驗孔分別加入100 μl DMEM全培養基和CAFs細胞上清液培養基，36 h后吸除培養基，往各孔中加入100 μl CCK-8檢測液，1 h后酶標儀測定450 nm處吸光度（A）值，以未輻射細胞作為對照組，檢測細胞活力，細胞活力（%）=[A（實驗）-A（空白）]/[A（對照）-A（空白）]×100，其中A（空白）為CCK-8溶液的吸光度，A（對照）為CCK-8溶液和無處理細胞的吸光度，A（實驗）為CCK-8溶液和CAFs細胞上清液培養基處理細胞的吸光度。

1.6 輻射后的腫瘤細胞γH2AX、xCT、STAT1蛋白表達情況檢測 采用Western blot法。獲得細胞沉淀后，加入細胞裂解液，4℃、12 000 r/min，離心 5 min，收集蛋白。采用BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度并調節蛋白濃度為 1 μg/μl。取 20 μl蛋白液進行凝膠電泳（SDSPAGE）和轉膜。將分離的蛋白轉移至PVDF膜上，使用5%脫脂牛奶封閉，加入鼠抗人一抗，4℃過夜。加入HRP標記的羊抗鼠二抗，室溫孵育2 h后。以GAPDH作為內參照，采用化學發光法將蛋白條帶曝光到膠片上，測定 γH2AX、xCT、STAT1 蛋白表達情況。

1.7 CAFs細胞上清液中GSH、半胱氨酸、胱氨酸水平檢測 采用高效液相色譜法將標準品溶液及CAFs細胞上清液經PBS稀釋后，用三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽還原，用三氯乙酸溶液進行蛋白沉淀，再用7-氟苯呋咱-4-硫酸銨鹽進行衍生化反應。實驗中色譜條件：柱溫29℃，流動相為甲醇，流速為0.8 ml/min，激發波長385 nm，發射波長515 nm。以標準品的位置及面積作為參照，計算GSH、半胱氨酸、胱氨酸水平。

1.8 統計學處理 采用GraphPad Prism 6.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CAFs的鑒定 流式細胞術檢測可見，CAFs為一群呈現 CD24、CD45、EPCAM陰性表達的細胞，而CD105、CD44、FAP 陽性表達，見圖1a、b（插頁）。HE染色可見，CAFs呈紡錘形或星形的扁平細胞（圖1c，插頁）。免疫組化可見CAFs中SMA呈陽性表達（圖1d，插頁）。

圖1 CAFs細胞的鑒定（a：流式細胞術檢測CAFs中CD24、CD45和EPCAM表達陰性；b：流式細胞術檢測CAFs中CD105、CD44和FAP表達陽性；c：觀察CAFs細胞形態，HE染色，×100；d：CAFs細胞SMA呈陽性表達，免疫組化染色，×100）

2.2 CAFs細胞上清液對輻射后肺癌細胞凋亡及細胞活性的影響 流式細胞術檢測發現，A549細胞在CAFs組的細胞凋亡占比為（59.7±3.3）%，無 CAFs組為（38.3±3.6）%；H460細胞在 CAFs組的細胞凋亡占比為（58.2±5.5）%，無 CAFs組為（29.8±3.9）%。CCK-8檢測發現，A549細胞活性CAFs細胞上清液培養基為（38.1±2.1）%，DMEM 全培養基為（59.1±2.4）%；H460細胞活性CAFs細胞上清液培養基為（37.8±2.3）%，DMEM全培養基為（58.6±4.6）%。見圖2。

圖2 CAFs細胞上清液對輻射后肺癌細胞凋亡及細胞活性的影響（a：流式細胞術檢測Transwell體系中輻射后的A549細胞凋亡占比；b：CCK-8檢測CAFs細胞上清液培養基和DMEM全培養基中輻射后的A549細胞活性，**P＜0.01；c：流式細胞術檢測Transwell體系中輻射后的H460細胞凋亡占比；d：CCK-8檢測CAFs細胞上清液培養基和DMEM全培養基中輻射后的H460 細胞活性，**P＜0.01）

2.3 干擾素-γ對CAFs細胞上清液GSH、半胱氨酸、胱氨酸水平及非小細胞肺癌細胞活性的影響 高效液相色譜檢測發現，加入干擾素-γ的CAFs細胞上清液中 GSH水平為（41.3±10.2）μmol/L，加入BSO為（39.1±9.6）μmol/L，加入 DMEM 全培養基（對照組）為（78.2±10.6）μmol/L，干擾素-γ和 BSO均明顯降低CAFs細胞上清液中的GSH水平（均P＜0.05）。在干擾素-γ作用后，CAFs細胞上清液中半胱氨酸水平為（47.8±4.8）μmol/L，明顯低于對照組的（86.9±8.7）μmol/L（P＜0.01），而胱氨酸水平為（133.0±10.8）μmol/L，明顯高于對照組的（73.7±5.2）μmol/L（P＜0.01）。CCK-8檢測表明，干擾素-γ和BSO兩者均降低了輻射后腫瘤細胞活性，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 干擾素-γ對CAFs細胞上清液GSH水平及非小細胞肺癌細胞活性影響（a：干擾素-γ和BSO對CAFs上清液GSH水平的影響；b：BSO對輻射后A549和H460細胞活性的影響；c：干擾素-γ對輻射后A549和H460細胞活性的影響；d：干擾素-γ對CAFs細胞上清液中半胱氨酸水平的影響；e：干擾素-γ對CAFs細胞上清液中胱氨酸水平的影響）

2.4 干擾素-γ對 CAFs細胞內 γH2AX、xCT、STAT1蛋白表達的影響 Western blot檢測結果表明，CAFs細胞上清液培養后使輻射后的A549細胞和H460細胞的γH2AX表達減少，而干擾素-γ作用后γH2AX表達增加。CAFs細胞內STAT1獲得激活并使其成為p-STAT1，后者可進入細胞核來實現其生物學功能。干擾素-γ作用CAFs后，細胞內胱氨酸轉運蛋白xCT表達減少，后者位于細胞膜上并發揮將細胞外胱氨酸轉運入細胞內的作用。見圖4。

圖4 干擾素-γ對CAFs細胞內γH2AX、xCT、STAT1蛋白表達影響的電泳圖（a：干擾素-γ處理后CAFs細胞內xCT、STAT1、p-STAT1蛋白相對表達；b：干擾素-γ處理的CAFs細胞上清液對輻射后A549細胞內γH2AX蛋白表達影響；c：干擾素-γ處理的CAFs細胞上清液對輻射后H460細胞內γH2AX蛋白表達影響）

3 討論

肺癌位居腫瘤相關死亡率第一位，5年生存率僅為15%[1-2]。非小細胞肺癌在肺癌中占比為85%，放療已成為非小細胞肺癌治療的重要手段之一，但是部分患者呈現對放療的抵抗及放療后腫瘤進展，導致患者預后不佳[3]。研究表明，作為腫瘤基質主要細胞CAFs對腫瘤發生、發展起到支持作用，誘導腫瘤細胞對放療發生抵抗[5]。因此，本研究先成功分離和鑒定非小細胞肺癌組織中CAFs，再通過Transwell和CAFs細胞上清液培養兩種方法實現CAFs與輻射后的肺腺癌細胞A549和肺鱗癌細胞H460共培養，繼而確認CAFs誘導非小細胞肺癌對輻射抵抗。該兩種非直接接觸共培養方式的結果說明，CAFs通過釋放某種物質來介導非小細胞肺癌細胞對輻射的抵抗，進而提高腫瘤細胞活性及減少細胞凋亡。

放療通過射線作用在腫瘤組織中形成羥自由基和超氧陰離子等活性氧（reactive oxygen species,ROS），后者通過氧化蛋白質、脂質和DNA進而損傷細胞以達到治療目的[8]。GSH是一種由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的γ-酰胺鍵和巰基的三肽，是抗氧化應激的主要還原劑[9]。研究表明，腫瘤細胞內GSH能抵消ROS的作用，從而維持腫瘤細胞的生存，增加對細胞損傷的耐受，繼而誘導腫瘤細胞侵襲及轉移[10]。基于此，筆者通過高效液相色譜檢測CAFs細胞上清液GSH水平，結果表明CAFs細胞上清液的GSH水平顯著性高于腫瘤細胞上清液，筆者推測CAFs通過釋放GSH來實現對輻射后肺癌細胞的保護。為了進一步說明來自于CAFs的GSH實現該效應，筆者在CAFs的細胞體系中加入BSO，結果表明，BSO降低CAFs細胞上清液中GSH水平并使輻射后的腫瘤細胞活性低于對照組。同樣，梁延杰等[11]利用肺癌小鼠模型開展相關研究，其通過降低肺癌細胞中的GSH水平來增加腫瘤細胞對輻射的敏感性，進而抑制腫瘤組織生長。

化療、放療和腫瘤靶向治療的療效與腫瘤微環境干擾素水平及CD8+T細胞數量呈正相關，后者殺傷腫瘤細胞時會釋放干擾素-γ[12-13]。Wang等[7]研究表明，干擾素-γ通過作用于CAFs以減少其GSH的釋放，進而提高卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。順鉑通過損傷腫瘤細胞DNA來實現治療，而射線輻射同樣具有破壞腫瘤細胞DNA的作用。基于此，筆者推測干擾素-γ具有與放療協同作用來控制腫瘤的生長。在用干擾素-γ對CAFs處理后，結果發現干擾素-γ同樣能減少CAFs細胞上清液GSH水平，同時發現輻射后肺癌細胞活性低于干擾素-γ對照組。干擾素-γ屬于Ⅱ類細胞因子受體家族的成員，其細胞膜受體為IFNGR，幾乎在所有細胞類型中均以中等水平表達（成熟紅細胞除外），與受體結合后通過JAK/STAT信號途徑發揮生物學功能，在JAK的催化下，STAT發生磷酸化形成p-STAT，繼而形成p-STAT二聚體，并轉移至細胞核內發揮生物學功能[14]，后者與xCT的特定啟動子區域結合后，快速抑制成纖維細胞xCT基因轉錄[7]。本研究中Western blot檢測同樣證明，經干擾素-γ處理后的CAFs呈現xCT蛋白表達下降，后者是糖蛋白相關氨基酸轉運蛋白家族的成員，表達于細胞膜上，為胱氨酸轉運蛋白[15]，xCT蛋白表達下降減少了胱氨酸用于合成半胱氨酸及GSH，進而消除了CAFs介導的肺癌細胞對輻射抵抗。在干擾素-γ處理組中輻射后腫瘤細胞內的γH2AX蛋白表達下調，該蛋白表達水平反映DNA損傷程度[16]，進一步驗證了干擾素-γ消除CAFs介導的非小細胞肺癌細胞對輻射抵抗。

綜上所述，研究者用源于非小細胞肺癌臨床標本的CAFs來開展研究，證明了該細胞通過釋放GSH來誘導非小細胞肺癌對輻射的抵抗。同時，干擾素-γ下調CAFs的胱氨酸轉運蛋白xCT表達并使GSH釋放減少，進而逆轉非小細胞肺癌對輻射的抵抗。電離輻射誘導CD8+T免疫細胞在腫瘤組織中豐度[6]，干擾素-γ可來自于該細胞，研究能夠為放療結合免疫治療用于非小細胞肺癌治療提供依據。